水产品兽药残留快速分析
[2010/6/4]
水产品兽药残留快速分析
1 水产品药残概论
药物在预防、治疗水产疾病中起到积极作用，但同时又带来了药物残留(简称药残)问题。目前，水产品药物残留问题日益严重，它不仅对人体健康造成潜在危害，而且还影响着水产品进出口贸易，已成为出口贸易的瓶颈，因此加强水产品药物残留监管，提高水产品质量安全已是刻不容缓。
1． 水产品药物残留的定义
水产品药物残留是指对人体健康产生重大影响的，在水产品的任何食用部分中，药物的原型化合物或者其代谢产物，及与药物本体有关杂质的残留。主要的残留药物有消毒剂、驱杀虫剂、抗菌药(抗生素、磺胺类、呋喃类)、激素类、基因诱导剂、疫苗等。
2． 水产品药物残留对人体的危害
对于大多数人们来说，主要是通过食用带有残留兽药的水产食品，这种接触几乎每天都有，是长期的。水产品药物残留对人体的危害主要有以下几个方面：
（1） 人类细菌耐药性增加
目前渔用抗菌药物使用范围和剂量的日益扩大，抗菌药药性残留于水产动物食品中，同样使人长期与药物接触，导致人体现人耐药菌的增加，耐药性的增强。现已研究证实细菌的耐药性可以通过耐药质粒在人群中细菌、动物群中细菌和生态系统中细菌间相互传递，导致致病菌产生耐药性。
（2）毒性损伤
药物残留可通过食物链长期富集而对人体造成一定程度的损伤。如：硝酸亚汞、甘汞等制品对鱼类小瓜虫的治疗效果好，但其在鱼体内易富集、残留，当人摄入后可引起肾损伤，表现为变性和坏死，引起肾功能降低。一些抗生素的长期使用和滥用在水产动物产品的残留也会造成一些潜在的危害。如：氯霉素可抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症；呋喃唑酮可引起溶血性贫血、多发性神经炎和急性肝坏死等；四环素类可抑制幼儿牙发育和骨骼生长；链霉素等氨基糖甙类抗生素损伤听神经和肾功能。
（3）过敏反应或变态反应
磺胺类、四环素类、喹诺酮类和某些基糖甙类抗生素等药物残留于水产动物性产品中进入人体后，就使得敏感个体致敏，产生抗体。当这些被致敏的个体再次接触这些抗生素时，则这些抗生素会与抗体结合生成抗原抗体复合物，激活体内肥大细胞和嗜碱性粒细胞，释放组胺、ECF-A、LTS、PG和PAF等物质刺激，集体出现平滑肌痉挛、身管扩张、微血管通透性增加、组织水肿、粘膜腺体分泌等病理损伤。过敏反应或变在临床上轻者可表现为有瘙痒的荨麻疹、恶心呕吐、腹痛腹泻，重者表现为血压急剧下降、迅速引起过敏性休克，甚至死亡。如磺胺类药物可引起人类的皮炎、血细胞减少、溶血性贫血和药热等临床症状。
（4）三致作用
即致癌、致畸、致突变作用。药物及环境中的化学药品可引起基因突变或染色体畸变而造成对人类的潜在危害。如水产常用促生长剂喹乙醇，现已证实有明显的蓄积毒性、遗传毒性和诱变性。长时间使用会在鱼体内残留，而对人的健康造成潜在的威胁，因此对于喹乙醇用于水产的安全性需进一步评价。水产上常用的治疗水霉病的药物孔雀石绿，是一种强致癌物。据报道鱼体短期一次接触孔雀石绿1/15000浓度，就可致细胞突变，现在许多国家和组织已禁止使用。硝基呋喃类药物（如呋喃唑酮、呋喃西林）近来的研究认为长期使用除了会对肝、肾造成损伤外，同时具有致癌作用和致畸、致突变效应。做为水产上常用的消毒药二氯异氰尿酸钠和三氯异氰尿酸过去认为是安全、高效的消毒药，但近来研究证实其在水体中的分解产物氰尿酸降解速度非常缓慢，且对人体有致癌作用。此外在水产上常用的杀虫药敌百虫、促生长剂乙烯雌酚、砷制剂等都已证明具有致癌作用。许多国家都已禁止这些药用于水产养殖。当人们长期食用含有三致作用药物残留的动物性食品时，这些残留物便会对人体产生危害，或在人体内蓄积，最终产生致癌、致畸、致突变作用。近年来人群中肿瘤发生率不断升高，人们怀疑与环境污染及动物性食品中药物残留有一定关系。
3． 水产品药物残留控制的意义
由于水产养殖药物残留具有三致作用、毒性损伤、激素样作用等危害，严重威胁人体健康，已成为人类的隐形杀手。近几年我国出口的水产品因药物残留问题屡遭禁运，首先是2001年9月，欧盟因氯霉素残留问题将我国出口到欧盟的冻虾产品纳入快速预警机制； 2002年3月，日本厚生省对我国出口到日本的动物源性产品实行严检，并向我方通报从福建进口的鳗鱼产品中检出大量氯霉素残留，同时公布了11种药物的最大残留限量。2006年上海市质量监督局从山东产的大鲮鲆中检测出硝基呋喃类代谢物超标，全国一片哗然。由此可见，我国从保障人民群众健康，水产养殖业要持续健康发展，水产品要进入国际市场的需要，必须严格控制药物残留。
4． 水产养殖中药物残留的控制措施
⑴根据药物在水产动物体内的药代动力学规律合理用药。
⑵开展多种形式的教育工作，提高全民关于水产动物食品安全性的整体认识，引导水产养殖者科学用药，推广健康养殖技术。
⑶加强和完善我国渔药残留的监控体系。
a.建立和完善水产品的安全保障体系，依法开展水产品无公害临界控制的检验检疫工作。
b.加强药物残留的方法和标准建设，在标准制定中要突出水产品安全卫生标准、质量标准、渔药使用规范、药物残留限量及相应的检测技术和检测方法的制定。
c.加快县市一级药物残留检测机构的建立和建设，使之形成从完善的药物残留检测网络机构，便于开展水产品中药物残留的常规检测，加强药物残留的监控力度。
2 水产品药残分析原理
1．水产品药残快速检测的构成要素
相应的检测仪器（酶标仪或专业分析仪TR-300）、样品前处理工具和检测试剂盒。
2．检测原理
采用免疫竞争法定量。微量反应板上包被有羊抗兔抗体，检测时加入特异性的待检药残抗体、待检药残标准品或待测样品溶液及辣根过氧化物酶标记的药残结合物溶液，室温（25℃）下反应，待测药残标准品或样品溶液及过氧化物酶偶联待测药残结合物竞争性地与待测药残抗体结合，形成抗原抗体复合物。洗涤后加酶反应底物和显色剂，结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色，在450nm处测量吸光度值，样品中的待测药残浓度与吸光度值成反比。
3 我国的分析标准
我国现行兽药残留分析的标准分两类，一类是国家标准，一类为农业部的检测方法，快速分析大多为农业部的检测方法。
4 应用及测试步骤
1．应用
水产品药残快速分析主要有两个方面的应用，第一是为了适应大量水产品的常规检测，对于各级水产品质量安全检测机构需要快速检测法，即使用快速检测法对大量样本进行初步筛选，再对初筛中具有超出农业部限量的结果的样本进行实验室验证，如应用HPLC、GC、MS、HPLC-MS等进行进一步测定。第二是为了适应随时随地的快速检测，对于县市一级的水产品检测机构，渔业合作社、水产公司、水产批发市的质量监管部门需要快速检测法，即在短时间内对样本作出判断，将具有超出农业部限量结果的产品阻止在流通环节之外。
1 海洋与渔业厅/市县局的水产品质量检测中心、水产种苗监督管理站
2 卫生厅/卫生监督所
3 人民政府食品办公室
4 内地水利水产局/水产股/渔政
5 产品质量监督检验所
6 出入境检验检疫部门
7 食品质量监督检测机构
8 工商局流动检测车
9 水产批发市场
10 农贸市场
11 大型厂矿
12 企事业单位
13 饭店，宾馆，超市
……
2． 我公司关于水产品药残快速测试步骤
（1）样品前处理（以氯酶素药残为例）
水产品（肉类）药残富集、提取器操作
------前处理氯酶素药残
一、 器具准备
1． 水产品（肉类）药残富集、提取器；
2． 离心机：4000rpm，6孔20ml角转子；
3． 20-200 ,100-1000μl数字可调移液枪各一支；
4． 手掌天平：100/0.01 g；
5． 组织均质器：2000-11000转/分；
6． 组织搅拌器：500转/分；
7． 10 ml具盖塑料离心管若干、20ml塑料离心管12个，50 ml若干塑料离心管4个；
8． 手术剪刀一个
9． 试剂：
乙酸乙酯（分析纯），100ml贮瓶；正已烷（分析纯），100 ml贮瓶；已稀释的组织样品萃取剂，50 ml贮瓶。
二、组织样品制备
称取100g去除皮、筋膜的鱼脊背肉组织，用手术剪刀按2х2cm剪成块，放入组织均质器中，每5秒一次，直至打成肉泥。
三、组织样品药残提取、富集
1．称取1g均质好的组织样品于10 ml具盖塑料离心管中，离心管置于提取架上，用移液枪吸取6000μl乙酸乙酯于离心管内，离心管上盖。
2．在药残富集、提取仪上，设定倒置计时时间为5分钟，倒入38℃左右热水于水浴器内1/2，超声发生系统开启，放入离心管，倒置计时时间为0时取出离心管。
3．离心管放入离心机中，2500 rpm离心8分钟。
4．用移液枪吸取4000μl上清液于另一离心管中，置于药残富集、提取仪吹淋系统架上，吹淋管放入离心管中（注意不能接触离心管内液面），打开气源发生器减压开关，调节吹淋系统压力为0.0015kg，50℃恒温吹干，过程约3分钟。
5．移液枪吸取1000μl正已烷（分析纯），溶解吹干后的离心管剩余物，超声2分钟，再吸取500μl已稀释的组织样品萃取剂加入离心管内，继续超声1分钟。
6．超声完毕的离心管放入离心机中，离心管上盖，2500 rpm离心8分钟，下层液相用于检测。
样品前处理完毕。
（2）样品检测
药残快速分析仪操作------氯酶素药残
一、检测仪器操作
开启药残快速分析仪，进入“药残快速分析”界面。
第一步 编程
点击“编程”， 进入编程界面，进行项目设定，点击“下级”进入编程
1． 项目名称和检测编号设定，
2． 下一级“波长”单、双波长选择，
3． 下一级“样品”单、双样和标准双样设定，
4． 下一级“检测方式”设定（吸光度值，定量检测），
5． 下一级“报告方式”设定（浓度值、正常值、稀释倍数），
6． 下一级“孔位设置”（空白、质控、标准孔）。
7． 下一级 “参数输入”（梯度标准值、单位、正常值/限量判定）
8． 编程结束，贮存。
第二步 点击“检测”进入检测界面
找到要检测的项目和编号，进入该项目
进行检测。
板孔设定如下（检测双样）
S=标准样品 T=测试样品
|
S1 |
S1-1 |
T1 |
T1-1 |
T9 |
T9-9 |
T17 |
T17-17 |
T25 |
T25-25 |
T33 |
T33-33 |
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S2 |
S2-2 |
T2 |
T2-2 |
T10 |
T10-10 |
T18 |
T18-18 |
T26 |
T26-26 |
T34 |
T34-34 |
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S3 |
S3-3 |
T3 |
T3-3 |
T11 |
T11-11 |
T19 |
T19-19 |
T27 |
T27-27 |
T35 |
T35-35 |
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S4 |
S4-4 |
T4 |
T4-4 |
T12 |
T12-12 |
T20 |
T20-20 |
T28 |
T28-28 |
T36 |
T36-36 |
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S5 |
S5-5 |
T5 |
T5-5 |
T13 |
T13-13 |
T21 |
T21-21 |
T29 |
T29-29 |
T37 |
T37-37 |
|
S6 |
S6-6 |
T6 |
T6-6 |
T14 |
T14-14 |
T22 |
T22-22 |
T30 |
T30-30 |
T38 |
T38-38 |
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T7 |
T7-7 |
T15 |
T15-15 |
T23 |
T23-23 |
T31 |
T31-31 |
T39 |
T39-39 |
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|
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T8 |
T8-8 |
T16 |
T16-16 |
T24 |
T24-24 |
T32 |
T32-32 |
T40 |
T40-40 |
标板设定按图4，根据检测量，可全选或部分选，标板设定完毕后，待检测操作完成后，点击“开始”进行检测。
二、加样记录准备
待所有试剂的温度回复至室温（约19℃至25℃）方可使用。为了减低边缘效应，建议在反应过程中用标板密封胶片将标板密封。每个标准或样品要做两份平行试验，并做好加样位置的记录。
三、检测操作
1．用移液枪吸取标准或样品25ul，分别加入到指定的微孔中，然后加入100ul酶标记物到每一个微孔中，用密封胶纸把反应板盖住。
2．左右轻敲反应板边缘数秒，将其置于室温下（19℃～25℃）培养1小时。翻转反应板，使孔内所有液体倾出。
3．吸取已稀释的洗涤缓冲剂250—300ul洗涤反应板4次，每次洗涤时，将所有液体轻轻倒出、拍干。
4．立刻用移液枪移取125μl单组分底物/发色剂到每一孔里。完毕后，左右轻敲反应板，将其放在避光处（约20℃至25℃）20±2分钟。
5．加入100μl0.2M硫酸终止反应，反应物的颜色会由蓝色转为黄色。
6．在10分钟内，上药残分析仪，测定，打印结果。
5 国内水产品药残快速检测市场分析
1．检测形式分析
目前国内水产品药残分两种检测形式，第一种为“两步法”，即酶标仪法，利用医疗检测设备酶标仪对水产品药残进行（OD值）的比色，测出OD值后，或利用电子计算器进行半对数计算，或利用试剂厂家提供的计算小软件进行数据整理，再求反对数结果；第二种为“一步法”，即专用药残分析仪法，利用专用药残分析仪，检测结果直接求出，并配有标准曲线图形，相关系数，回归线性方程的斜率和截距，检测一目了然。（对于政府部门对于水产品药残的市场管理，可设定出农业部的限量标准，检测结果直接显示和判定是否超标）
虽然有的酶标仪厂家也给出了定量计算公式，但由于检测试剂不同，稀释倍数不同，也没办法直接得出结果。
2．前处理工具分析
以往水产品药残快速检测项目，政府或用户招标采购后，酶标仪只做为终端机使用，最多配几只移液器，往往忽略前处理工具的采购，二次采购需要增加德国进口均浆机，氮吹仪，震荡器，培养箱等设备，增加很大成本，且仪器设备多而笨重，实现不了便携现场检测。
GZTRAD水产品药残快速检测仪的前处理采用超声萃取技术，所用设备为模块化的药残快速富集提取器，前处理设备和检测仪器集中在两个工具箱内，可实现便携现场检测。
6 GZTRAD水产品（肉类）药残快速检测仪特点
1. 见宣传材料。
2. 定标曲线带曲线修正功能，很大程度上避免了检测试剂对检测结果的影响。
3. 标准曲线的存贮，节省昂贵的检测试剂。同一检测试剂，最少可进行一个样品的检测，最多可进行84个样品检测，而不用再做定标曲线。
7 药残快速分析仪仪器维护及质量保证
1．仪器维护
1．1概述
本仪器在正常使用过程中,只需正常的清洁维护即可，但以下部件经长时间工作后，可能会出现失效或故障，请到指定维修点维修或请用户在专业人员指导下进行维修。为了使仪器保持一个良好的状态，必须做好日常维护工作。
警告：仪器的维修需要专业人员操作，在维修或其他原因拆卸外壳时必须切断电源，并且闭主机。
1.2 清洁仪器
1）保持仪器工作环境的清洁。
2）仪器表面的清洁，可以用中性清洁和湿布擦试。
3）液晶显示器请用柔软的布清洁。
警告：请勿让任何溶剂、油脂类、腐蚀性物质接触仪器。
1.3 仪器部件更换
1.3.1 更换保险丝
1） 关闭电源开关。
2）保险丝安装在仪器后面电源开关旁边的保险丝盒中，拧开保险盒十字螺钉，更换同种规格的保险丝。保险丝规格：φ5×20 250V、2A。
1.3.2 更换滤光片
滤光片经过一段使用后，基透射率会有所下降。当下降到仪器不能正常工作时，仪器会自动给出显示，提醒用户及时更换。更换方法如下：打开仪器上盖，找到滤光盘，查到失效的滤光片，取出已失效的旧片，换上新片即可。
1.3.3 更换光源灯
当光源灯损坏时，仪器也会自动给出显示，这时可打开仪器上盖，经检查确定是灯泡损坏时，拔下灯插座，用手轻轻由下向上取出灯泡，更换上新的同规格灯即可。如果更换新灯泡后，仪器仍指示有故障，请及时通知本公司专业人员前去调试。
1.4 简单故障处理
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现 象 |
原 因 |
解 决 方 案 |
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仪器不能启动 |
电源不正常 |
检查是否通电，电源插头不否松脱，保险丝是否断路，电源电压是否合格。 |
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托盘运动不正常 |
步进电机引线插接不良；同步带松脱；运动部件移位卡住支，定位光耦松脱或损坏 |
校正传动机构，请专业人员调整。重新检查各联接线，拧紧松动光耦。 |
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自检不正常 |
光系统故障；波长设置不对 |
查看光源灯是否亮，重新设置一次系统的波长值。 |
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检测结果不正确 |
光源灯和滤光片老化 |
及时更换新的光源灯和滤光片 |
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打印机灯常闪 |
打印机接收故障，传送数据出错 |
关掉打印机电源，等一会再打开；更换打印控制板 |
2． 质量承诺
从发货之日起一年内，本仪器若因质量问题不能正常工作，本公司将无偿为用户修理或更换元器件或更换该产品。对于违反规定或者用户自拆卸导致仪器损坏，则须收取维修工本费，一年以后，本公司负责该仪器的终身维护。
河南、湖北、湖南、广东、广西、海南： 杨经理 19811942171 微信同号
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