微生物实验室的安全操作规程

　　1 实验室安全

　　1.1 微生物实验室的生物安全性

　　1.2 科室安全文档

　　(a)生物危害防护：实际操作规程见(《实验室生物安全通用要求》，中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布，2004-10-01实施。)

　　(b)实验室安全：原则和措施见(《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布，2003-08-01实施。)

　　1.3 应用：

　　以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。

　　1.4 关于新规定或现行规定的修改案：

　　任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员，他们将建议科室主任考虑实施。

　　1.5 生物性危害

　　1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于：

　　a.处理的传染性物质的本身：

　　按照传染性物质对个人和社区和潜在危险性以及经空气传播的可能性，其划分成不同等级。所采用的等级划分详见"《实验室生物安全通用要求》";原则和措施(见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》)。

　　b.使用的设备和设施：

　　处理不同等级的传染性物质的要求在"实验室安全"中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作，科室负责人必须保证中应污染物水平。

　　c.培训，特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练，能安全处理任何实验室可能碰到的物质，避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室，即使暴露事故在实验室，即使暴露事故发生也要会正确处理。

　　1.5.2 传染性物质的分类

　　1.5.2.1分类系统

　　生物危害防护：[见1.2 (a)]，根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级，危害等级Ⅳ最具危害性。

　　1.5.2.2危险群/生物安全水平：1-4

　　a.危险群/生物安全水平：1——对健康成人无致病性，对社区无危害性。通常一般微生物操作就足够，不需特殊安全设备，工作的附近要有洗手设施。培养基上包含未鉴定物，因此，妥善处理对各级安全水平都至着重要。

　　b.危险群/生物安全水平：2——人类疾病相关物质，这种物质对实验室工作人员有中度危险，并具有一定程度社区危险性。医院微生物室所涉及的绝大多数物质属此安全水平，生物危害警告应张贴，并且限制接近，应用醒目标语，若是能产生空气传播或飞溅的I，II类物质都就使用相就的操作台。实验室就提供类似防护衣和手套，眼罩尤其是配戴隐形眼镜者，也应提供类似安全水平的洗手设施，并且临近工作区也应有高压灭菌装置。所有废物和反复使用设备的去污染应有特定的程序。

　　c.危险群/生物安全水平：3——人类疾病相关物质，具有潜在空气传播性，能引起严重，致命疾病，对实验室工作人员高度危险，并具有一定程度社区危险性。所有含有或怀疑含有生物案的标本必须标以"小心污染"标签，并且同时标于盛放标本容器和申清单。然而作为预防保护还不足够。应对所有血液，体液，分离的人体组织等有普通防护意识，它们都应视作传染源。在此生物安全级，实验室应控制对其接近。凡涉及该类物质都应使用I或II类工作台操作，也可以遵循II级操作注意事项，对所有废物进行去污染处理，包括工作服和重复使用设备。

　　d.危险群/生物安全水平：4——对个人的危险如生物安全3级，但对社区有高度危险性。这些传染性物质包括：

　　蜱源性脑炎病毒

　　支里半亚-刚果牛血热病毒

　　Marburg Virus

　　艾波拉病毒

　　Lagsa fever Virus

　　Junin HF Virus

　　Machupo HF Virus

　　Guanaruto HF Virus

　　Herpesvirus simiae (B Virus)

　　1.6 以下预防措施，所有实验工作人员必须遵守：

　　1.6.1 工作服

　　a.所有实验室成员在工作期间必须始终穿着所提供的工作服。离开实验室时，工作服须挂在指定地方，不得在实验室外冼工作服。

　　b.在处理含有或怀疑含有生物安全3级物质的标本时，必须在工作服外穿隔离衣。

　　c.在生物安全操作台内处理标本和培养基时，必须戴手套。

　　1.6.2 洗手池

　　洗手池须供应洗洁剂和纸巾。

　　1.6.3 洗手

　　所有工作人员在离开工作区必须洗手，并且要先脱去工作服和手套。

　　1.6.4 食物，饮水，吸烟，化妆品

　　食物和饮料不允许带入任何处理标本的房间.不允许在处理标本的任何地方吸烟.不允许在处理标本的任何地方使用化妆品。

　　1.6.5 伤口和擦伤

　　手上的伤口和擦伤必须覆盖保护物。

　　1.6.6 个人衣物

　　个人衣物不允许带入实验室，并且必须保存在带锁的柜子里。

　　1.6.7 口吸移液管

　　这是禁用的。要求使用机械移液装置。

　　1.7 常规预防措施应用于所有血液、体液、组织标本的操作中：

　　1> 无论何时都应尽可能避免使用注射器，针头或其它锐器。

　　2> 使用过的针头和一次性切割器必须丢入专门的带有盖子和桶内，以备安全处理、防止容器过满盛装。

　　3> 使用过的针头不许重新使用或再用手操作。

　　4> 打烂的玻璃必须放入坚硬的容器(不要用手)，然后再放入黑色垃圾袋，如果是污染的，使用黄色垃圾袋。

　　5> 在接触具有潜在性传染性标本培养基、组织，必戴保护性手套，防止皮肤直接接触。如果手套有可见的污染，必须先除去污染，再更换。手上有皮炎或伤口的工作人员的需要间接接触传染性物质的人员应戴保护性手套。

　　6> 在处理完标本、结束工作，甚至在上述规定带手套时，应常规洗手。

　　7> 当血液、血液制品或其它体液污染发生时，应停止工作洗手，戴一次性手套再清除污染区。建议用含有效氯1000ppm的次氯酸钠溶液。如果污染区较大用浸有次氯酸钠溶液的湿布覆盖10min去污染，并标示相应的警告，丢弃废物及手套到生物安全级物理容器。注意飞溅的水滴和流淌会将污染带到主污染区以外。

　　8> 所有在实验室使用的具有潜在污染性的物质都需去污染，最好先高压，再做处理。

　　9> 任何可能产生飞溅或气雾的操作都应在生物安全操作台里进行。这些操作包括离心，分离血清，混合，超声，收集组织受精卵，以及处理含有浓集的感染物质标本。

　　1.8 实验室物质处理

　　a> 黑色塑料袋用来收集未污染或经高压过需处理的废物。

　　b> 废纸屡用来收未污染的废纸，用过的纸巾等。

　　c> 所有可能传染的物质必须高压或焚化。

　　d> 所有丢弃的标本，培养基和实验室废物必须放在专门容器里

　　e> 用白色聚丙烯罐盛装2%新鲜配置次氯酸液，以供工作中丢弃标本，污染吸头，棉拭子临时处理待一天工作结束之后，再经高压处理。

　　f> 黄色塑料袋用来处理污染的实验室废物。它们应封口再由工人拿去焚烧。

　　g> 带盖，带标签硬质容器用来盛装针头的锐器。

　　1.9 实验室传染性物的消毒

　　高压

　　a.所有培养基的传染性物质都要高压，除非准备焚烧的，高压的最大好处是使传染性物质离开实验室可保证安全。

　　b.用作此目的的高压设备应在医学技师监督下由实验室工人操作。

　　c.高压设备应定期由医院设备组测试，检修。这些测试包括商业使有的芽胞试纸实验。多个高压设备应有使用记录，并自使用之日起由医学技师连续记录。任何不符都要向安全人员报告。

　　1.10 去污染

　　去污染剂：

　　1> 次氯酸溶液：用白色聚丙烯罐装新鲜配置的含有效氯1000ppm的2%次氯酸溶液，放在多个工作室。

　　2> 5%的Printol：其50%水溶液用来处理溅在地板和家具上的污染。

　　3> 戊二醛：新鲜配制成一定浓度，主要用于不能使用次氯酸钠的仪器去污染，如离心机等。

　　4> 75%乙醇：主要用于对清洁表面的快速去污染。

　　1.11 离心机

　　1.11.1 注意事项：

　　a> 使离心机用的试管应具是厚管或塑料的，离心前应仔细检查是否缺损。

　　b> 离心机需放置在合适的位置，操作都应能看见离心缸，以便能正确地将离心架放在转子上。

　　c> 离心桶和离心架配对使用，负载后需仔细平衡。

　　d> 为避免脱架和试管内溶液溅出，开始采用低转速，然后逐渐升高。

　　e> 离心机内缸应由高级人员定期检索，内壁必须用戊二醛定期清洁，去污染。

　　f> 在对含有或怀疑含有生物安全操作3级标本离心时，必须加盖密封，密封盖只有在一级生物安全操作台内才能打开。

　　1.11.2 离心时，试管破裂

　　a> 如果正在离心时，发生或怀疑发生试管破裂，电动机应立即断电，并在30min后才能打开离心机盖。

　　b> 如离心后发现破裂，应立刻关闭机盖，保持至少30min。

　　c> 立即通知安全员。

　　d> 戴厚手套，使用镊子或用镊子夹棉鉴清除破碎玻璃碎片。

　　e> 所有破裂试管，玻璃碎片，离心桶和转子必须放在专门消毒剂中去污染，要求消毒剂不具腐蚀性，对浸生物安全物质有效。然后，或者浸泡至24小时，或者高压。

　　f> 未破裂，带盖的试管也应放在另一含有消毒剂的容器中1后，再对其内容物处理。

　　i> 离心缸必须用戊二醛棉拭子清洁，过夜，再重复擦拭，再用水清洁洗净并干燥。

　　g> 含有生物安全3级物质的密封离心桶必须在密封状态下取出，在一级生物安全操作台内打开。如果试管破裂，离心桶密封盖应松松地盖上，对离心桶高压。

　　1.12 破裂和溢出

　　任何重要的破裂的溢出都应通知安全人员。在处理含有或怀疑含有生物案例的溢出物，应先得到安全人员的建议。

　　1.12.1 病毒培养基的泄漏

　　a> 用浸有20%次氯酸钠的纸巾覆盖溅洒出的污染物用容器碎片。

　　b> 覆盖10-15min。

　　c> 戴一次性手套，清扫纸巾和碎片于合适的容器(如塑料袋，但不包括含有碎玻璃或其它锐利物体)，用一片硬纸板去清扫，不能用刷子或尘掸，除非它们适于高压。手指远离碎玻璃。

　　d> 将碎片和使用后的废物放在实验室废物箱。

　　e> 用常规工作消毒剂擦拭污染区及其周围可能飞溅区。

　　1.13 泄漏的标本

　　实验室不泄漏的标本，但要以塑料密封后退还到病房。

　　1.14 紫外线消毒：培养基，试剂分装和病人血清应存放-70°C和-30°C冰箱。操作存放于-30°C或以下温度冰箱物质，应戴手套，例如当标本从低温冰箱取出或放入时。

　　1.15 生物安全柜(台)

　　实验室应配备II级生物安全柜。

　　1.15.1 级别

　　I ：基本要求：定向流动保护，要求气流从外流入安全柜，并且远离操作者，指向传染物。经HEPA过滤排后，紧好由导管引向室外，以便清除去污染后的各种蒸汽。

　　II：基本要求：经过滤气体垂直流向，既保护操作者也要保护工作不受污染。

　　IIA：70%的过滤气体重新循环至工作区，废气导向室外经HEPA过滤。和内流经式工作区的气流速度平均0.4m/s或略高。

　　IIB：流进气体流速平均0.5m/s或更好。按照不同型别(IIB1，IIB2，IIB3)，气体排出比例从70%到100%。根据工作选择不同型。如有毒化学物质和放射线同位素不能再循环至工作区。

　　III ：基本要求：操作者与传染物安全隔离，并且整个操作过程都要提高。安全柜所在的环境也要一定程度隔离，以防手套破裂。

　　1.15.2 生物安全柜的安装

　　安全柜要发挥某安全防护功能必须注意安装位置，废气应通过管道以保护环境不受污染。如果需购置这类设备应联系CUHK安全办公室，在种类，牌子，样式，安装位置和安装以及与其它设施的相邻关系上获得指导。

　　1.15.3 常规检查和安全操作以及工作区的消毒

　　有一份操作规程详尽地叙安全柜的常规使用也应包括安全柜发生意外时应采取的行动。每一个使用者必须阅读规程使后签名。

　　1.15.4 注意：

　　安全柜应尽可能避免使其处于不安全状态，但有时因为安全柜的意外，使用者被迫这样做。此时，应张贴注意以警告其它人不得再使用。

　　1.15.5 去污染和再认证

　　由受过训练的人员,配戴个人防护用具,来做污染工作。要求：安全柜在密闭条件下用干燥多聚甲醛蒸汽醺蒸，使用浓度8500ppm。(安全柜的体积应包括外周供应和废气过滤设备。)在温度20-25°c，相对温度不低于60%环境保持4h，甲醛蒸汽，如果允许，可直接抽出室外，若不允许可在安全柜内用氨基重碳盐吸收。

　　因为空气有限的穿透力，在处理潜在传染性物质时最好使用HEPA过滤器，以及高压或焚化后再丢弃。

　　1.17.5.2 再认证

　　这项工作由专门人员进行，去污染后安全柜性能再认证定，及过滤器的更换，测试是否有漏气，调试空气流速是否合规定，以及检测过滤器的性能。再认证应至少一年做一次，或是装置移动，过滤器维修后。应备有去污染，维修和再认证的记录，并且应方便使用者的查阅。

　　2. 实验安全操作程序：

　　2.1 工作人员在采集标本过程中应当防止病原微生物扩散和感染，并对标本的来源、采集过程和方法等作详细记录。

　　2.3 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。

　　2.4 处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，均应在生物安全柜中进行。

　　2.5 使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。

　　2.6 稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。

　　2.7 使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。

　　2.8 菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。2.9进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。

　　2.10 试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。

　　2.11 实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。

　　2.12 实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。

　　2.13 实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。

　　3. 实验室污物处理及消毒操作程序：

　　3.1 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒 2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。

　　3.2 可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。

　　3.3 实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。

　　3.4 培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。

　　3.5 实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。

　　3.6 实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。

　　3.7实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。

　　4. 意外事故处理程序：

　　4.1 如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员和医院生物安全办公室，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。

　　4.2 实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。

　　4.3 如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中 、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上(其间适量加溶液防止干燥)，再经紫外灯近距离(1米内)照射2小时以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，再次着防护衣进入房间，将污染溢出物和用于清洁的纱布放入可耐受高压的双层塑料袋内并尽快高压。

　　4.4 如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜;第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒(乙醛消毒法﹕5ml乙醛+2g高锰酸钾/m3空间)。

　　4.5 临床医务人员应对事故受害者和消毒人员进行医学随访。