高灵敏度分子发光光谱分析技术应用心得

　　一.概述

　　化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。

　　化学发光Western 杂交检测，是同位素检测的一种高度灵敏的替代方法。酶标记抗体取代了放射性标记抗体，当它作用于底物时，可产生光信号。多数特异抗原检测方法以辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)二级抗体耦联物为基础。信号可通过感光胶片或专用的成像设备来采集。化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史，目前大部分实验室做转印时都会采用化学发光技术进行检测。随着冷CCD化学发光检测技术的发展，现在越来越多的实验室都开始采用冷CCD的凝胶成像系统进行化学发光的检测，胶片成像虽然比自然发光法灵敏度更高，但也有很多缺点：耗时，需要暗房，显影剂和胶片，胶片较贵且为需持续购买的消耗品。同时由于胶片的线性范围较窄，因此用胶片上的条带(特别是表达量较低的条带)进行定量几乎不可能。冷CCD技术与X胶片相比具有瞬时影像处理、高灵敏度和高分辨率、动力范围广等优点，因此能对条带进行精确定量。当然这项技术要求底物能产生高强度长持续时间的信号，以保证信号能被冷CCD的凝胶成像系统捕获。在这方面多家公司都提供了相应的化学发光底物或试剂盒，特别是Bio-Rad公司提供的Western-C化学发光检测试剂盒，底物可产生高强度的持续光信号24小时，因此用户可以进行多次曝光，最低可检测至10-19mol，配合Bio-Rad屡获大奖的化学发光成像系统ChemiDoc XRS或VersaDoc系统能得到得到高质量的印记信号。

　　我们实验室从05年开始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS进行化学发光的检测，目前已经形成一套较为成熟的技术路线，取得大批的实验数据。本文将就Western Blotting的关键步骤及使用ChemiDocXRS的一些心得体会与大家一起分享。

　　二.转印过程

　　转印蛋白的方法有多种，最常用的是电泳转印方法，该技术具有快速、有效、并保持蛋白在凝胶中高分辨率的特性。电泳转印技术是指在凝胶中分离的蛋白质向印迹膜载体转印的过程。由于该技术可以准确、快速、高效的将蛋白转印到膜上，并可以保持蛋白在凝胶中高的分辨率，而被广泛的应用于转移印迹技术中。

　　常用的电泳转印系统有槽转印系统和半干转印系统，前者是将凝胶和印迹膜浸入转印缓冲液槽，然后加电压进行转印;后者是将凝胶和印迹膜放置于滤纸间形成三明治结构，而后在电极平板间进行转印。

　　电泳转印过程中，凝胶和印迹膜平行放置于两极间，见图。根据欧姆定律(Ohm’s)：

　　V=I*R，R为两极间物质的电阻值，(即转印缓冲液、凝胶、印迹膜、滤纸的电阻值)，当电极两端加有电压时，就会在上述物质间产生电流，蛋白样品便发生转印。

　　由于两极间的电场强度(V/cm)是蛋白转移的驱动力，因此两极间的电压和距离称为凝胶上蛋白转印的关键参数。同样其他参数包括蛋白的大小、形状、所带电荷多少，电转印缓冲液的pH值、黏度、离子强度、以及凝胶密度也影响着蛋白的电转印效率。

　　在转印过程中将产生大量热量，因此对电场强度要有一定的限制。转印中产生的焦耳热(Joule)与电源参数P成正比，P=I*V=I2R。电泳转印缓冲液的温度随着焦耳热的增加而升高，此时其电阻却明显下降。电阻的降低将会使转印过程和电场强度发生变化，从而影响电转印缓冲液的缓冲能力。同时，系统过热还会引起凝胶的损坏或与印迹膜发生粘连。从而槽体的散热能力将直接影响电泳转印效率。

　　本室主要以湿转进行转印，因此本文就湿转为例，对化学发光和ChemiDoc XRS的应用进行叙述。

　　一、转膜(湿转)：

　　(1)转一张膜需准备2张6.5*10cm的滤纸和1张5.5*8.5cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分钟才可使用。

　　(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、两张滤纸和浸过的PVDF膜。

　　(3)打开夹子将黑的一面放入转膜液中，从下往上依次放入海绵、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵。

　　注意:1整个过程在转膜液中进行在铺每一层时要用刮子赶气泡，尤其是胶与膜之间一定不能留有气泡。

　　2撬玻璃板剥胶时动作要轻，用刮子将浓缩胶轻轻刮去小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐

　　(4)将夹子合好，放到转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。接通电电转移时会产热，在槽的一边有较大空隙，放入事先准备好的冰盒来降温。将整个电泳槽放入一个大的容器中(大的塑料泡沫盒子最好)，在这个容器中盛满冰。

　　(5) 250毫安恒流转膜2小时。

　　(6)2小时后，将膜取出，用TBST洗膜5分钟。

　　(7)用5%脱脂奶粉室温封闭。

　　封闭是为了使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。

　　脱脂奶粉要用TBST配置，要在干净的容器里进行封闭，且足以覆盖住膜。

　　二、孵育一抗

　　一抗用BSA溶解，根据抗体说明书上的要求稀释抗体(大部分稀释度为1：1000)，4℃过夜。 也可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

　　(有些一抗室温孵育一小时也可得到满意的结果)

　　三、孵育二抗

　　室温孵育1小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:2000。

　　二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。

　　注意：孵育二抗之前一定要用 TBST将膜洗三次，每次五分钟，时间一定要够。

　　洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

　　四、曝光

　　本实验室选用威格拉斯 “western 发光检测试剂盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化学发光试剂盒(已针对CCD成像做了优化)，可获得更好的效果。

　　(1)洗膜，2至3次，每次5分钟

　　(2)在照胶仪放膜的平板上加少许水，取一张与平板大小合适的保鲜膜铺在平板上，排气泡。

　　作用：

　　a 保证PVDF膜能在一个相对干净的平台上曝光，避免污染。

　　b 铺上保鲜膜后，背景颜色是纯黑色且深浅均匀，这样当半透明的PVDF膜在白测光下照Marker时，会更清晰、明显。

　　(3)将膜放入照胶仪，调整明暗、大小、焦距，在目的条带的marker出，用圆珠笔标一个印记。

　　(4)选择EPI WHITE 光，点击“White Epi IIIumination”点击 Auto Expose 获取marker图片，图片最大化，选中图片，选择file ->export to jpeg，quantity调至最大值100，保存至文件夹。保存为jpeg格式后，转至其他电脑即使未安装quantity one 软件也可用其他图像软件编辑图片。

　　(5)将发光液A液和B液按1：1比例混匀、倒在PVDF膜上，发光液能盖住膜即可，关闭WHITE EPI光(注意膜的位置从照Marker开始，不要改变)点击“Chem Hi Sensitivity”，点击“Live Acquire”选择合适的曝光时间，张数，选择指定文件夹，保存。

　　选择比较满意的图片，按如上所说转换至jpeg格式。

　　例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比较好曝的，可以调至10s一张，一般10张之内就可得到好的效果。其他不太容易出条带的，可以适当延长时间。

　　对于内参来说，在曝第一张之前，让发光液倒在膜上静置反映20-30秒，有时会得到理想的效果。

　　(6)marker与目的条带的比对：用 window自带的“图片和传真查看器”软件打开jpeg格式的marker图片，用手在屏幕上点住刚刚用圆珠笔画的印记，手不要松开，此时还用“图片和传真查看器”打开jpeg格式的目的条带的图片，手点的地方就是刚才marker的位置。

　　结论：采用Bio-Rad的冷CCD化学发光成像系统进行化学发光的检测，比传统的暗室曝光方法更为简便，也大大缩短了实验时间。但在成像时需要注意选择合适的化学发光试剂，以适合CCD的成像检测。且大部分的化学发光试剂均对应暗室曝光的方式，因此在进行检测需要进行调整，如对发光液不能进行稀释，而必须要使用原液。同时如果条带的表达比较弱的情况下，如使用常用发光液可能需要更长的成像时间，当然更好的方法是选择能快速产生强烈信号的化学发光试剂，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化学发光试剂盒。