PCR工作机制及高级使用

　　PCR的工作机制

　　PCR由一系列复杂的化学反应，包含前、中、后三个阶段。最重要的化学变化是热循环期间的产物合成。每次循环后产物、模板、聚合酶、引物和脱氧核苷酸的余量都会改变，处于连续的不稳定状态。所有的循环都是从模板和先前产物的变性开始。当温度较低时，引物退火到模板上。

　　早先若干循环的退火步骤要求引物寻找正确的染色体模板作为它们的目标。在中期的循环中，先前合成的产物优先成为模板。最后几个循环中，增扩后的高浓度产物互相杂交，由此阻止与引物的杂交。

　　引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板综合体上，提取介质中的自由dNTPs然后沿着模板延伸。从本质上讲，引物和模板的任何反应都会造成产物扩展，它们的特异性在最初的几个循环中可能很难控制，得到非特异性产物的摩尔量超过在模板上正确退火位置的量。PCR反应特异性的可靠度依赖于2个引物必须定位到互补的DNA链上。进一步讲，退火温度和Mg2+离子的浓度影响引物稳定的杂交到模板上，杂交位置间距应小于10kb。

　　相比之下，增扩阶段的大部分循环里，模板被很好的与先前增扩的片段区分开。这些片段的数量取决于早先若干个循环的严密性。甄选同源性引物的退火位置是较简单的，增扩期间由染色体DNA贡献的有效的模板数量只是可以忽略一小部分。甄选的复杂性被超量由引物从互补位点新增扩的片段所降低。

　　PCR的化学计量

　　热力学方面的影响对PCR来讲是试剂浓度和模板间的对应关系。在起先的循环中PCR试剂的摩尔比率是最高的，随着PCR产物的增加而降低。令人惊讶的是这种减低是由增扩的目标分子的增加引起的而不是由于试剂的消耗。最初剩余的引物和脱氧核苷酸与模板的比率是固定的，反应结束后，dNTP的浓度下降超过1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶没有变化。增扩千万倍目标分子后，模板分子远多于酶分子。当产物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率减低，推动自身退火。当自身退火的数量增加或酶的总量有限时，反应处于饱状态并停止指数级的增长。增扩阶段是自我受限的。这个阶段之后，热循环转向未在最初几个循环中被选择的欺骗性的目标增扩，尽管能够通过提高开始时Taq DNA聚合酶和引物的含量来维持高试剂比率，但这种修改很可能引起丢失特异性因为引物会胡乱杂交，出现额外的条带和斑点。

　　热启动(hot start)PCR

　　用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR对提高PCR特异性尤为有效。 尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在PCR配制过程中，热循环刚开始，以及保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。

　　限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，无法完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。方法包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，暂停并保持温度在70度以上。手工加入聚合酶，这个方法过于烦琐， 尤其是对高通量应用容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分如镁离子、酶、模板、缓冲液包裹起来，物理地分隔开。热循环开始后，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。蜡防护层法与手动热启动法一样比较烦琐，易受污染，不适用于高通量应用。

　　还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。

　　Booster PCR

　　整个PCR反应过程中引物前后担任2种功能，筛选探针和增扩引导。在最初的几个热循环期间，每个引物作为探针独立地活动，筛选所有目标。如果一对引物与目标杂交，方向和位置都正确，就意味着目标选择的工作完成了。接下来在以后的循环中这对引物引导增扩反应。

　　增扩低浓度的模板(等于或小于100个模板)比如单个细胞，石蜡化的组织有不同的特点。筛选阶段相对于模板而言要有更多剩余的试剂。稀释的模板造成难以筛选，因为引物和模板相遇和频率被大大的降低了。这种情况更有可能引起引物之间形成二聚体。Booster PCR是解决这个问题的方法。在此步骤中，第一个循环阶段使用稀释后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大约在107:1。以确保开始扩增时的准确性，在增扩阶段提高引物的浓度到正常水品。

　　嵌套的引物

　　如果增扩出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之间，从大范围看增扩出的目标是同源的。引物杂交的严密性在最初若干个循环里是宽松的，允许较高的错配偏差。这个效果能通过低于计算得到引物退火温度来达到。第二步选择明确的产物，严谨地选择一条已知染色体片段用来增扩。简单点说就是设计两对引物, 一对是长的，另一对短的是包含在长引物内的，用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板，这样可以增加产物的量而且可以减少非特异性带和错配的情况.

　　假阴性

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。

　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　假阳性

　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。

　　出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数