显微镜的分类知识

　　按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜;按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜;按观察对像可分为生物和金相显微镜等;按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等;按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等;按接收器类型可分为目视、数码(摄像)显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。

　　1. 双目体视显微镜

　　双目体视显微镜又称"实体显微镜"或"解剖镜"，是一种具有正象立体感地目视仪器。在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术;在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。它具有如下特点：

　　(1) 利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角--体视角(一般为12度--15度)，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。

　　(2) 象是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来的缘故。

　　(3)虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长。

　　(4)焦深大，便于观察被检物体的全层。

　　(5)视场直径大。

　　目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜----变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为"连续变倍体视显微镜"(Zoom-stereo microscope)。随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。

　　2. 金相显微镜

　　金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

　　3. 偏光显微镜(Polarizing microscope)

　　偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片(起偏器)，使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器)，这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。

　　偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

　　(1) 偏光显微镜的特点

　　将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。

　　(2) 偏光显微镜的基本原理

　　偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。

　　(3) 偏光镜检术的方式

　　正相镜检(Orthscope):又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜(Bertrand Lens),

　　被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

　　b. 锥光镜检(Conoscope)：又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。

　　(4) 偏光显微镜在装置上的要求

　　a. 光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

　　b. 目镜：要带有十字线的目镜。

　　c. 聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

　　d. 伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。

　　(5) 偏光镜检术的要求

　　a. 载物台的中心与光轴同轴。

　　b. 起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

　　c. 制片不宜过薄。

　　4. 荧光显微镜

　　荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光显微镜广泛应用于生物，医学等领域。

　　(1) 荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。

　　a. 透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。

　　b. 落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。

　　(2) 荧光镜检术的注意事项

　　a. 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。

　　b. 作油镜观察时，应用"无荧光油"。

　　c. 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。

　　d. 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

　　目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交(FISH)等等。

　　5. 相衬显微镜(Phase contrast microscope)

　　在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度)，对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。

　　相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜中。

　　相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求：

　　a. 环状光阑(Ring slit): 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大a.

　　小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。

　　b. 相板(Phase plate):

　　装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面;另一是通过衍射光的部分，?quot;补偿面"。有相板的物镜称"相衬物镜"，外壳上常有"Ph"字样。

　　相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法，想要得到好的观察效果，显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面：

　　a. 光源要强，全部开启孔径光阑;

　　b. 使用滤色片，使光波近于单色。

　　6. 微分干涉对比显微镜(Differential interference contrast DIC)

　　1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope)，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y)，二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。

　　微分干涉对比镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。

　　(1) 原理

　　微分干涉对比镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。

　　(2) 微分干涉对比镜检术所需的特殊部件：

　　a. 起偏镜

　　b. 检偏镜

　　c. 渥拉斯顿棱镜2 块

　　(3) 微分干涉对比镜检时的注意事项

　　a. 因微分干涉灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。

　　b. 具有双折射性的物质，不能达到微分干涉对比镜检的效果。

　　c. 倒置显微镜应用微分干涉时，不能用塑料培养皿。

　　7. 倒置显微镜(Inverted microscope)

　　倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。

　　由于上述样品特点的限制，被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为"倒置显微镜"。

　　由于工作距离的限制，倒置显微镜物镜的最大放大率为60X。一般研究用倒置显微镜都配置有4X、10X、20X、及40X

　　相差物镜，因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要，也可以选配其它附件，用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。

　　目见倒置显微镜广泛应用于patch-clamp ,transgene ICSI 等领域。

　　8. 数码显微镜

　　数码显微镜是以摄像头(即电视摄像靶或电荷耦合器)作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入摄像头取代人眼作为接收器，通过这种光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。