厌氧菌的分离、培养及鉴定

　　一摘要：

　　1.1实验内容：

　　厌氧菌的分离、培养及鉴定;

　　1.2目的：

　　1掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。

　　了解厌氧菌菌鉴定的一般方法。

　　2复习并巩固平时所学的微生物知识与技能。

　　3培养独立思考、设计和动手实验的能力。

　　二介绍：

　　厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。

　　专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

　　厌氧菌的培养：

　　在培养厌氧菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说，要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。

　　厌氧菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术因此他是世界上第一个分离纯化厌氧菌的人。

　　以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验;任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。

　　三实验材料与设备：

　　3.1分离与培养：

　　3.1.1菌种：待测样品;

　　3.1.2培养基：改良的PRAS培养基(氮素自加)

　　[配方组成——NH4CL1g,MgCl20.1g,K2HPO40.4g,KH2PO40.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青(还原指示剂)1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S(还原剂)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制剂)各0.1ml]

　　3.1.3试剂：冰块Na2SNaHCO3

　　3.1.4器材：高纯氮气厌氧管厌氧手套箱注射器恒温培养箱铜柱除氧系统定量加样器厌氧罐超声波破碎仪酒精灯冰块水浴锅记号笔振荡器等

　　3.2菌种的鉴定：

　　3.2.1菌种：待测菌

　　3.2.2培养基;糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基(液体);

　　3.2.3试剂;乙醚吲哚试剂卢戈氏碘液;

　　3.2.4器材：超净工作台恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅接种环移液管载玻片显微镜等

　　四、实验方法与步骤：

　　4.1分离与培养

　　4.1.1铜柱系统除氧

　　铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。

　　4.1.2预还原培养基及稀释液的制备

　　在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。

　　4.1.3分离

　　(1)编号

　　取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

　　(2)稀释

　　在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。

　　(3)滚管分离

　　1)滚管

　　将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0.1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

　　2)分离纯化

　　生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

　　3)划线分离

　　将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。

　　4.1.4镜检与计数

　　(1)镜检

　　挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

　　(2)计数

　　液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有厌氧菌数量cfu/g(mL)样品=A×10ml×X/10×D

　　A-0.1mL滚管计数的实际平均值;

　　X-镜检呈现为厌氧菌的数目;

　　X/10-菌落中厌氧菌的概率;

　　D-稀释倍数

　　4.2菌种的鉴定

　　4.2.1糖发酵试验

　　糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

　　具体实验步骤：

　　①将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　②将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。

　　4.2.2蛋白质分解实验

　　①将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　②将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。

　　4.2.3淀粉水解实验

　　①将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　②将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。

　　五注意事项及注释：

　　1注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。

　　2注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。

　　3用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。

　　4树脂刃天青(resazurin)既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色(培养基的颜色)，它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。

　　5培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为厌氧菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。

　　6注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充，然后插入培养基的下层，以保证当培养基移入试管时，就处于无氧气体层的下面。