电泳基础知识

　　1、 电泳法(三个主要的方法，步骤)

　　电泳法

　　电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。

　　各电泳法，除另有规定外，照下述方法操作.

　　第一法 纸电泳法

　　1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。

　　常用的水平式电泳室装置如图，包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5～0.8cm)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F，此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般在500～10 000V。

　　2. 操作法

　　(1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)。取枸橼酸 (C6H8O7•H2O)

　　39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7•2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。

　　(2) 滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm处做一记号备点样用。

　　(3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10μl,共3点，并留2个空白位置。干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。

　　(4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源档,

　　调整电压梯度为18～20V/cm，电泳约1小时45分钟，取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。

　　(5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条,分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量.

　　第二法 醋酸纤维素薄膜电泳法

　　1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。

　　2.试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解

　　使成1000ml。

　　(2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

　　(3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。

　　(4) 透明液 取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。

　　3.操作法 (1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。

　　(2) 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2～3μl,在10～12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5cm为宜。

　　(3) 染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。

　　(4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10～15分钟，取出平铺于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。

　　(5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对含量(1%)。

　　洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全， 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占比率(1%).

　　第三法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

　　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白按分子大小分离。

　　1.仪器装置 恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。

　　2.试剂

　　(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g与亚甲基双丙烯酰胺1.6g，加水至

　　200ml，滤纸滤过，避光保存。

　　(2)分离胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml，用盐酸调节pH值至8.8，加水至100ml。

　　(3)浓缩胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml，用盐酸调节pH值至6.8，加水至100ml。

　　(4)电泳缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸钠1.0g，加水至1000ml。

　　3.操作法

　　(1)制胶 用30%丙烯酰胺溶液-分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分离胶液，灌入模具内至一定高度(剩余体积留作制备浓缩胶用)，用水封顶，聚合完毕，倾去水层。再用30%丙烯酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成浓缩胶液，灌在分离胶上，插入样品梳(如为圆盘电泳，用水封顶)，待浓缩胶液聚合后，小心除去样品梳或水。

　　(2)对照品和供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。

　　(3)电泳 垂直板电泳：恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调至150～200V，当溴酚蓝迁移胶底处，停止电泳。圆盘电泳：调节电流使每管8mA。

　　4.固定与染色

　　(1)考马斯亮蓝染色

　　①试剂 a.固定液 称取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水

　　至500ml。b.染色液 称取考马斯亮蓝R<[250]>0.5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml与冰醋酸50ml，再加水至500ml。c.脱色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，摇匀。

　　②固定与染色 电泳完毕，取出胶片(条)，置固定液中30分钟，取出胶片(条)，置染色液中1～2小时，用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。

　　(2)银染色

　　①试剂 a.硝酸银溶液 取硝酸银0.8g，加水至4.0ml，将此溶液滴加到0.1mol/

　　L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液1.5ml的混合液中，摇匀，用水稀释至100ml。

　　b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。

　　c.显色液 取1%枸橼酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。

　　d.终止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。

　　②固定与染色 胶片浸在固定液中至少2小时后弃去固定液，用水浸洗至少1小时;胶片置1%戊二醛溶液中15分钟后，用水洗2次，每次15分钟;胶片置硝酸银溶液中15分钟后，用水洗3次，每次15分钟;胶片置显色液中，待各带显出后置终止液中。

　　5.计算

　　用卡尺或用扫描定位法测量溴酚蓝指示剂和蛋白迁移距离(如为圆盘电泳还应测量染色前后胶条长度，垂直板电泳胶片厚度低于1mm，染色前后胶片长度基本不变)。按下式计算相对迁移率：

　　蛋白迁移距离 脱色前胶条长度

　　相对迁移率(R’<[m]>)=

　　脱色后胶条长度 溴酚蓝指示剂迁移距离

　　(1)分子量 以R’<[m]>为横坐标，标准蛋白的分子量对数为纵坐标，进行线性回

　　归，由标准曲线求得供试品的分子量。

　　(2)纯度 取胶片(条)，置薄层扫描仪，以峰面积按归一化法计算。

　　(3)结果判断 供试品主成分迁移率应与对照品迁移率一致.

　　2、 制备凝胶板的方法

　　等电聚焦电泳与琼脂糖电泳过程中凝胶板的制备方法和简单操作

　　等电聚焦电泳

　　1.制备凝胶板

　　1)30%凝胶母液的制备

　　丙烯酰胺30克，N、N双甲叉丙烯酰胺0.8克，加蒸馏水至100毫升，溶解后过滤,贮存于有色瓶内.

　　2)准备制胶模具

　　准备玻璃板凉快，相应压条三根.同样大小的玻璃纸及聚碳酸脂薄膜各一张(也可不用).文具夹若干.上述用品洗净晾干后备用.

　　先将玻璃纸用蒸馏水浸透，平放在一块玻璃上，放三根压条于其上(这样就形成一个胶室)，再放聚碳酸脂薄膜，最后放一张玻璃板，放压条的地方用文具夹夹紧，两块大约错开一公分，以备由此处灌胶.

　　3)聚丙烯酰胺凝胶板的制备

　　取30%凝胶母液3.2毫升，依次加50%分析纯甘油3.6毫升,双蒸馏水10毫升，40%载体两性电解质0.72毫升，10%过硫酸胺0.1毫升，(最好用时配制，或在制备一周内使用)，充分混合后，从框垫开口处注入玻璃板夹层内的玻璃纸和聚碳酸脂薄膜之间的空间内，室温放置1小时左右，去掉文具夹及聚碳酸脂薄膜及其上的玻璃板，既为聚丙烯酰胺凝胶板.

　　4)打开低温循环器开关使水温降至4℃左右.

　　2.加样

　　用1*0.5(或0.6*0.5)厘米滤纸片在0.1-0.5%浓度的样品液中浸润，贴于凝胶板1.5-2厘米处，与凝剿班的方向平行，每个样品滤纸片间隔0.5厘米.

　　3.电泳

　　1)放置电级纸条，以3-4层宽0.6-1.0厘米、长10厘米的干滤纸条以1mol/L氢氧化钠置于凝胶板阴级侧的边缘，同样的滤纸条浸以1mol/L磷酸置于阳极侧的边缘.

　　2)将铂金丝电极板放于凝胶板上，使连接电源阳极和阴极的电极丝分别压在阳极侧和阴极侧的电极滤纸条上，最后盖好电泳槽盖.

　　3)接通电源开关，按下"预置"开关键，预置电压、电流及功率的参考值分别为2500V、50mA、功率80W.然后按下开关键，电源即有输出，电泳开始.一般选择稳压或稳功率，电泳时间1-1.5小时.

　　4.固定

　　电泳结束后，凝胶板以12.5%三氯醋酸固定20分钟.

　　5.染色

　　取0.4克考马斯亮蓝R250加入120毫升甲醇液中20克三氯醋酸，12克磺基水杨酸，蒸馏水400毫升，制成考马斯亮蓝染色液，将经固定的凝胶板放置于染色液中，60℃水浴中染色30分钟.

　　6.脱色

　　乙醇、冰醋酸及蒸馏水按1:3:6的比列缓和即为脱色液.将染色后的凝胶板放置于该脱色液中，室温下脱色24-43小时.

　　7.绘PH曲线(此步骤需在电泳结束后，固定之前进行)，测等电点.

　　8.照相

　　凝胶板干燥处理后保存或照相后保留底片.

　　琼脂糖电泳

　　1.先用胶条封住凝胶托盘两端，然后放在水平台上.把试样格固定在试样格架上，放在凝胶托盘合适的位置上.把配置好的琼脂糖凝胶倒如槽中(主义琼脂糖凝胶的温度不要超过60℃).待凝胶聚合后，轻轻拔掉试样格.

　　2.在电泳槽两端活动槽中加上缓冲液，把凝胶托盘两端的胶条撕掉并移到电泳槽中.

　　3.用与凝胶等同宽度的四层滤纸约20mm长，并折成直角;滤纸的一端搭在凝胶板上，另一端浸在缓冲液中.

　　4.点样.

　　5.插上电源线，接同电源开始电泳.

　　6.主义不要接错正负极，检查无误后打开电泳仪电源开关.根据凝胶板的薄厚选择适宜的电压与电流即可电泳.

　　7.电泳实验结束后，先关闭电泳仪电源开关;随之打开电泳槽取出凝胶托盘.

　　8.观察和照相：在254nm或300nm紫外灯下观察，或用135照相机加橙色滤光片在紫外分析仪上照相.

　　3、 SDS-PAGE胶的干燥

　　胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。

　　(1)试剂与配制：

　　固定液：冰醋酸:甲醇:水(10:20:70)

　　(2)电泳后的凝胶用5～10倍体积固定液在室温下固定，酸性固定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消失后，继续固定5min。为防止凝胶破裂，在进行步骤(2)之前可将凝胶浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中过夜。

　　(3)将凝胶标记好方向后放在保鲜膜或玻璃纸上面，上面放一张比凝胶四周长出1～2cm的Whatman 3MM滤纸。

　　(4)另将一张滤纸放在凝胶干燥器上。将Whatman 3MM滤纸/凝胶/保鲜膜或玻璃纸，放在凝胶干燥器上的滤纸上面，保鲜膜或玻璃纸在最上面。

　　(5)放下凝胶干燥器的盖子，抽真空使凝胶四周封闭以干燥凝胶，干燥时间常由厂家提供，一般0.75mm厚凝胶干燥2h，如50～65℃可加快干燥进程。

　　释放真空。如加热状态下干燥，则先停止加热并自然冷却10min后再释放真空。