杂质蛋白鉴定与定量的完美结合-Hi3分析方法

　　液质数据中，不但含有蛋白药序列表达是否正确的肽图信息，其它杂质蛋白同样可以被挖掘出来。然而，单纯的杂质蛋白鉴定却又是不够远远的，其确切的含量信息同样至关重要。沃特世PLGS软件可以在肽图液质数据中，进一步鉴定其中的杂质蛋白，并其相对含量信息进行分析。

　　一、“顺便”完成的杂质蛋白鉴定与相对定量

　　使用相应的开放数据库，PLGS软件首先根据液质数据中的离子碎片信息对多肽进行鉴定，进而组装出样品中的所有蛋白，完成蛋白鉴定步骤。在蛋白相对含量测定中，PLGS软件充分利用了MSE全信息串联质谱方法的数据优点。较DDA方法，MSE数据的离子色谱峰近乎“完美”，更加符合实际多肽色谱峰型。通过全面研究发现，MSE数据中的多肽色谱峰强度信息，与蛋白浓度相关性非常好。使用每个蛋白鉴定多肽中，强度前三的多肽峰强度加和值，即表征其蛋白浓度。因此，使用PLGS分析同一个肽图液质数据，便可“顺便”完成杂质蛋白的鉴定与相对定量工作。

　　二、蛋白绝对含量测定

　　如果想得到样品中准确的蛋白绝对浓度信息，也非常简单。只需在样品中加入一个已知的蛋白内标便可。这时Hi3分析方法会根据内标蛋白的浓度，按照以下公式，对样品中的绝对浓度进行定量。

　　三、使用Hi3方法分析残留宿主细胞蛋白(HCP)

　　融合抗体anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用中国仓鼠卵巢细胞系DG-44 CHO在两种培养条件下表达，表达后的PTG1 mAb再分别使用A、B两种方法纯化。经过2D-UPLC MSE方法采集液质数据后，使用PLGS软件分析[3]。在分析结果中，可以明确地给出鉴定到样品中含有的杂质蛋白，以及给出这些杂质蛋白的相对含量结果(图1)。为了验证Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法对以上实验结果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三个蛋白进行了定量验证。通过Hi3与MRM两种定量方法结果对比，可以发现两者定量浓度非常接近(图2)。在使用PLGS进行样品中的杂质蛋白鉴定与定量分析中，检索方法设置与肽图分析几乎一致，只增加将参考蛋白的名称与浓度列入分析参数一步。之后，所有的分析过程都将由PLGS自行完成，并直接给出蛋白鉴定身份与浓度的结果列表。实际上PLGS不仅使用在生物药杂质蛋白分析中，在样品极为复杂的蛋白质组学研究中，Hi3方法已经被长期使用。