生物大分子的离心分离实验

　　一、引言

　　在八十年代以前，生物大分子(特别是核酸、蛋白)用离心方法分离纯化占有很重要的地位。用分析超离心方法测定生物大分子的分子量、沉降系数、扩散系数、微分比容等在生物化学实验中也占有一席之地。八十年代以后，由于离心技术的快速发展(微处理器的引入，变频驱动的完善、转速的提高等等)，先进的制备用超速离心机已经能够替代昂贵的分析机型完成M.S.D 等参数的测定。分析超速离心机在实验离心技术领域转向与其他实验技术(如NMR，x 衍射等)结合研究生物大分子的结构功能。

　　进入九十年代，电泳技术的发展使得原来用离心技术来测定生物大分子分子量的方法又变得落后了。用电泳技术测定分子量M.方法简单、快速、成本较低(文献2， 3)。而近年来用核酸与蛋白的快速测序方法来测定生物大分子的一些参数，比用离心法、电泳法更先进，精度更高。(文献4，5)

　　尽管如此，离心分离方法还是以它的部分优势存在着：分离范围广，容量大;可以研究天然生物大分子的流体动力学特性;可以在电离介质中进行生物大分子的片段分离;对缓冲剂限制很小(在电泳技术中由于电流的热效应而限制了缓冲剂的使用)等等。另外在各种实验方法的前处理阶段，离心法还是被广泛的使用着。考虑到各个研究部门的设备分布情况，在很多条件下，离心分离的使用还具有相当的广泛性。作为有效的分离纯化方法，差分离心、速率区带密度梯度离心和等密度离心在生物大分子的研究中还占有重要地位(文献1)。

　　二、生物大分子的离心分离要点：

　　(1) 防止污染：

　　要避免在实验过程中由于生物大分子部分受损而引起降解或变性，引起降解的原因很多，如实验过程中的外力作用;某些酶污染等等，但最常见的原因是酶的作用。

　　实验过程中由于污染某些脱氢酶进入样品而使生物大分子变性。

　　避免的方法：

　　(i)用抑制剂来降低脱氢酶的作用：常用的抑制剂有DFD(二异丙基磷酸氟)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、EDTA(1~10mM )、SDS(0.1~1% )、DEPC(焦碳酸二丁酯)(0.1%)……。

　　(ii)对所有接触样品的容器(离心管、管盖组件、移液器、移液管等等)进行彻底消毒(蒸汽消毒或0.1%DEPC 侵泡)。

　　(iii )由于实验人员皮肤表面有酶存在，所有实验必须使用经过消毒的手套操作。

　　(iv)合适的PH 值：过度的酸碱度也会使生物大分子降解。

　　(2) 避免变性的其他注意事项：

　　(i)转头在离心前预冷到接近离心温度(在冰箱中放置过夜，或在恒温箱中保温)。对于超速离心机，其制冷系统主要用于抵消转头在稀薄空气中高速运转(转头表面线速度从亚因速—>超因速)时气动力摩擦产生的热量。在真空中，只有辐射传热的情况下，高速运转的转头温度从室温(如夏天30~35℃)降到5℃时间很长(如1 小时左右)一般应预冷到接近离心温度(±2℃)以确保在离心的最初阶段(15 分钟以内)转头温度和样品温度一致。

　　(ii)用固定角式或近垂直管转头或垂直管转头作梯度离心时必须利用离心机的慢加速(0~500rpm )、慢减速(500rpm~0)功能，以保证梯度方向的顺利转换。

　　(iii)离心开始、离心结束都要小心地轻放和轻取离心管，避免大的震动。

　　(iv)卸样过程应在无震动的实验台上进行，环境温度和离心温度相近，卸样方法应选择平稳、外力作用很小的方式，尽可能不用泵输送样品。

　　(3) 有关梯度离心的其他要点：请参照文献(8)(9)，本文略。

　　(三)生物大分子的离心分离实例：

　　例(1)去蛋白的RNA 分离：

　　(i) 样品匀浆加入9 倍容积的冰冷20mM Tris-HCl( PH8.0 ) 1mMEDTA 。

　　(ii) 加入1/10 容积的10% SDS，再加入等容积的(苯酚：氯仿：异丙醇)(容积比50：50：2)溶液并含有0.1% 的8-羟基喹啉溶液充分混合使其乳化。

　　(iii) 以上溶液在10,000xg 离心10 分钟。

　　(iv) 移出上清液，重复(ii)(iii)过程一次。

　　(v) 第二次离心后上清液中加入1/10 容积的3M 醋酸铵，充分混合后再加入二倍容积的乙醇，并在-20℃静置二小时以上。

　　(vi) 10,000xg 5℃离心10 分钟得到RNA 沉淀。

　　(vii) 用干燥的N2 气体蒸发掉沉淀中残留的乙醇。

　　(viii) 将RNA 溶于20mMTris-HCl(PH8.0)，1mMEDTA 中，-20℃低温保存待用。

　　例(2)从大肠杆菌中分离质粒DNA：

　　(i) 溶液制备：

　　溶液I：50mM 葡萄糖，10mM(EDTA)，25mM Tris-HCl(PH8.0)

　　溶液II：0.2M NaOH，1% SDS

　　溶液III：3M 醋酸纳(PH4.8)

　　TE 缓冲液：10mMTris-HCl(PH7.4)，2mM EDTA

　　(ii)E. Coli 培养液1 升(量大按比例配置)

　　(iii)将1 升培养液在4,000rpm(约2,000xg)，5℃离心20 分钟，得到细菌沉淀。

　　(iv)用100ml 冰冷的溶液I“洗”沉淀，再次离心，4,000rpm，5℃， 20 分。

　　(v)用20ml 冰冷溶液I 将第二次离心沉淀调成均匀悬浮液。

　　(vi)每ml 悬浮液加入2mg 溶菌酶，并在0℃冰浴中放置10 分钟。

　　(vii)加入40ml 溶液II，轻轻搅拌后，在冰浴中放置5 分钟。

　　(viii)加入30ml 溶液III，在冰浴中放置20 分钟，使蛋白质大部分沉降。

　　(ix)在高速冷冻离心机上用角式转头，10,000rpm(约10,000xg )离心15 分钟，5℃。

　　(x)小心地倒去上清(不扰动沉淀)，在沉淀中加入55ml 异丙醇， 即得到粗制的质粒DNA 溶液。

　　(xi)粗制DNA 液在-20℃静置15 分钟以上，再在12,000rpm(约15,000xg)4℃离心5 分钟，倒去上清液。

　　(xii)真空中抽去异丙醇，沉淀中加入18ml 经过消毒的TE 缓冲液， 在沉淀溶解后再加入0.65ml，1% E.B.

　　(xiii )以上溶液每ml 加入分析纯CsCl 1 克，使其完全溶解，检测溶液折射率应为1.3890(密度≈1.587)

　　(xiv )用以上溶液按照参考文献(6)所介绍的方法作质粒DNA 分离。

　　(xv)离心后在300nm 紫外光下可显示DNA 带(线性DNA 带和质粒DNA 带，RNA 沉淀在底部，蛋白质浮在液面)。

　　(xvi)用文献(1)介绍的方法取出质粒DNA，抽提去掉E.B. 透析法或脱盐柱去除CsCl 。

　　例(3)用CsCl 梯度分离DNA 并测定其组成(% G+C)

　　(i)CsCl 溶液密度D 与溶液中CsCl 的重量百分比浓度P 之间的关系： D=138.11/(137.48-P)

　　(ii) 制备初密度为1.706 克/毫升的梯度液，应按以下要求配置

　　·4.85 克CsCl (分析纯)

　　·50μl ，1.0M Tris-HCl(PH7.4)

　　·20μl， 0.2M EDTA(PH7.4)

　　·0.5ml DNA 样品

　　·3.3ml 重蒸水

　　(iii) 用光折射仪检测CsCl 的初始密度D，设测得的光折射率为RI，则有 D=10.8601×RI-13.4974

　　(iv) 测得的RI 应为1.4000，如果检测值大于此值，再加重蒸水容量为V(毫升)，梯度液的总容量为G(毫升) V=1.52×G×(D 测定-D 需要) 如果检测值小于1.4000，那么再加固态CsCl(W)克W=1.32×G×(D 需要-D 测定)

　　(v) 再测溶液折射率直至调整RI=1.4000

　　(vi) 将配置好的液体充满于5ml 的一次性快速密封离心管，并利用封口机密封。

　　(vii) 固定角式转头150,000xg ， 20 ℃离心50~55 小时(约35,000rpm)或垂直管转头300,000xg，20℃离心12 小时(约55,000rpm )

　　(viii) 离心后利用梯度仪或手工收集成50 管(每管100μl)。

　　(ix) 对每管样品测定折射率至小数4 位，测试过程中应保持样品温度为20℃，根据折射率RI 计算各管样品的密度D。

　　(x) 每管中加1 毫升重蒸水，在260nm 波长时分别测各管光密度(OD)，如果DNA 已做了同位素标记，那么还要对收集的样品分别做液体闪烁计数仪测定辐射值。

　　(xi) 以离心管容量为横坐标(从管底至管面)，分别以各管测得的OD 值或同位素放射计数值为纵坐标作曲线。找到曲线的峰值位置即可做DNA 定位。

　　(xii) 用下式计算DNA 组成：

　　%(G+C)=(D-1.66)/0.098×100 如果能在离心样品中加入标准DNA，计算就更加准确。

　　说明：

　　·进入90 年年代以后用DNA 测序法或在260nm 波长加温溶点法进行测定比离心法更简单，究竟用什么方法要由使用单位现有设备来决定。

　　·在不用E.B.(溴乙锭)的情况下，用CsCl 梯度分离DNA 一般不会影响DNA 的构型。

　　·某些梯度材料如Cs2SO4 在离心过程中形成的密度梯度太陡而不适合做质粒DNA 离心。

　　·某些非电离性的梯度材料(如Nycodenz )也不适用于此类离心。

　　例(4)用CsCl 梯度纯化RNA

　　·配置溶液：

　　I：7.5M 氯胍，50mM 醋酸纳(PH7.0)

　　0.1M 2-巯基乙醇，0.5% Sarkosyl 。

　　II：10mMTris-HCl(PH7.4)，2Mm EDTA 。

　　·实验步骤:

　　(i) 在溶液I 中制备细胞匀浆,每克细胞加入10ml I 溶液.

　　(ii) 匀浆离心, 8,000rpm(约8,000xg),5℃,10 分钟,固定角式转头,PA 或PP 离心管。离心后倒出上清液备用。

　　(iii)用容量为13-14ml，最高转速在40,000-41,000rpm 的甩平转头，钛合金吊桶，PA 离心管，每管下部铺设2ml，5.7M CsCl(在溶液II 中)，上部为(ii)离心后的上清液。离心转速31,500rpm(约185,000xg)，10℃离心18 小时，或用固定角式转头，每管下部铺设3ml，5.7M CsCl (在II 中)，上层的(ii)离心后的上清液， 65,000rpm(约410,000xg)，10℃，离心2 小时(慢加速，慢减速)。

　　(iv)离心后，小心地倒去上层蛋白质，中层的DNA，已经初步纯化的RNA 沉淀在离心管底部。

　　(v)沉淀中加入0.5ml 溶液I 并移入1.5ml eppendorf 管，再在微量离心管中加入0.5ml 溶液I，摇匀。

　　(vi)在离心管中加50μl，1M 醋酸(在500μl 乙醇中)。

　　(vii)离心管置于低温冰箱中-20℃静置1 小时以上。

　　(viii)台式离心机12,000rpm(约11,000xg)离心10 分钟。倒去上清液，沉淀为RNA (进一步纯化的)。

　　(ix)沉淀溶于400 μl 溶液II 并假如40μl 3M 醋酸纳(PH5.0)(在880μl 乙醇中)。

　　(x)-20℃静置过夜。

　　(xi)第二天，用高速台式离心机12,000rpm(约11,000xg)离心10 分钟，倒去上清液， 沉淀用70%乙醇洗二次。

　　(xii)将RNA 溶于II，用凝胶电泳检测(用薄层扫描仪或凝胶电泳分析仪分析结果)RNA 构型，用分光光度计(1 毫克/毫升RNA 在260nm 时光密度为25)测定RNA 浓度。

　　(xiii)将已知构型及浓度的RNA 在-20℃储存。

　　例(5)：用KI 梯度分离RNA 片断。

　　(i)将DNA 样品溶于15mM 柠檬酸钠，10mM 亚硫酸钠，5mML 磷酸钠(PH7.0)中，最终浓度不超过50μg/ml。

　　(ii) 每毫升RNA 溶液加入1.0 克KI，充分溶解后用折射仪测定RI=1.4290，如过高，过低必须修正到比值。

　　(iii) 将以上溶液充满12ml，PA 快速密封离心管，密封后置于固定角式转头中，150,000xg，20℃离心60 分钟。

　　(iv) 分部收集离心管中梯度液(30-50 管)，可用RNA 试剂定位，如果RNA 已做同位素标记，可用液闪仪定位。如果用后一种方法，在分部收集管每管中加一滴(25 μl 左右)巯基乙醇以避免在液闪仪液体中产生自由离子。

　　(v) 用此法可以分离单股与双股RNA。

　　例(6)用Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子

　　样品：初步离心后的蛋白-核酸混合液梯度液：

　　3.00g Cs2SO4

　　2.5ml 8M 尿素(经过混合床去离子处理的)

　　50μl 1.0M Tris-HCl(PH7.4)

　　25μl 0.2M EDTA(PH7.4)

　　1.25ml 样品的水溶液

　　以上各项充分混合后注入5ml PA 快速密封管

　　固定角式转头 130,000xg，5℃ 离心64 小时，慢减速

　　或600,000xg，5℃ 离心14 小时，慢减速

　　甩平转头 400,000xg，5℃ 离心22 小时

　　·结果分析：其中蛋白用35S 同位素标记

　　RNA，DNA 用32P 同位素标记

　　离心后样品分布收集成30 管，在液闪仪上测定，绘出从离心管表面—>管底的容量为横坐标，同位素32P， 35S 计数为纵坐标的曲线图，很明显可以找到蛋白，DNA，RNA 的峰位置。

　　例(7)用RbCl 梯度分离不同密度的蛋白质：

　　配置：样品：经过初步分离的蛋白质 50μg-200μg

　　1.75g RbCl

　　0.5ml 1M Tris-acetate (PH7.1)

　　水容量=3.25ml

　　(充分混合后注入离心管)

　　固定角式转头，5ml PA 管

　　250,000xg，5℃ 65 小时，慢减速

　　或 600,000xg，5℃ 27 小时，慢减速

　　甩平转头 400,000xg，5℃ 42 小时

　　离心后沿离心管长度方向分部收集成50 管。

　　用分光光度计分别测各管O.D.值，以管容量为横坐标，O.D.值为纵坐标绘制曲线， 可以找到各种蛋白的峰位置。

　　例(8)用CsCl-Cs2SO4 梯度分离RNA 片断：

　　配置：

　　1.9ml 饱和的CsCl 液

　　1.7ml 饱和的Cs2SO4 液

　　1.5ml RNA样品(5-10μg 溶于0.1M Tris-HCl(PH7.5)及10mM EDTA)

　　0.25ml DMSO(5%)

　　充分混合后注入5ml PA 离心管

　　离心二次： 第一次170,000xg，25℃， 18 小时(固定角式转头)

　　第二次100,000xg， 25℃， 48 小时(固定角式转头)离心后沿离心管长度方向收集30-50 管，用比重计测密度。

　　(因为是CsCl 与Cs2SO4 混合梯度，不能用光折射仪测RI)。

　　结果：横坐标为管容量，纵坐标为密度绘制曲线，可以找到不同密度RNA 所在位置。

　　例(9)用NaBr 梯度分离血清脂蛋白：

　　(i) 溶液配置：

　　干燥的NaBr 晶体，在210℃恒温箱中过夜，分别配置下列不同密度的NaBr 液体：

　　1.006克/毫升(9 克/升)

　　1.019克/毫升(27 克/升)

　　1.063克/毫升(95 克/升)

　　1.210克/毫升(283.4 克/升)

　　1.386克/毫升(524.8 克/升)

　　所有的溶液均含0.05% EDTA(PH7.0)，溶液经过滤后储存在暗褐色瓶中，4℃保存。

　　(ii) 实验过程

　　(1) 人全血1,000xg 离心10 分钟去除各种血细胞，上清液为血清。

　　(2) 0.2ml 血清与0.8ml，1.386 克/毫升的NaBr 液混合。

　　(3) 将已稀释的血清样品1ml 置于14mlPA 管底部，然后往上依次铺设梯度液

　　3.2ml,1.21g/ml NaBr 液

　　3.8ml,1.063g/ml NaBr 液

　　3.3ml,1.016g/ml NaBr 液

　　1.2ml,1.006g/ml NaBr 液

　　(4)甩平转头，260,000xg，14℃，24 小时

　　各种密度的脂蛋白从管底浮向它们自己的等密度区形成了纯的各种密度脂蛋白区带。而离心管底部保留着各种血清蛋白。

　　(5) 用上排法从离心管中抽出各层液体，由蠕动泵输送经过带流动池的紫外­可见分光光度计经检测光密度(O.D.)值后用部分收集器收集于0.5ml eppendorf 管中。

　　(6) 从分光光度计的O.D.曲线，可以从0.5ml 离心管中给各种不同密度血清脂蛋白定位。