常用菌种保藏方法

　　微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

　　低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

　　一、保藏方法大致可分为以下几种：

　　1.传代培养保藏法

　　又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用)，培养后于4—6℃冰箱内保存。

　　2.液体石蜡覆盖保藏法

　　是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

　　3.载体保藏法

　　是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

　　4.寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

　　5.冷冻保藏法

　　可分低温冰箱(-20—-30℃，-50—-80℃)、干冰酒精快速冻结(约-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。

　　6.冷冻干燥保藏法

　　先使微生物在极低温度(-70℃左右)下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。

　　有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

　　二、器材:　　细菌、酵母菌，放线菌和霉菌;

　　肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95%酒精，10%盐酸，无水氯化钙;

　　灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管(长颈球形底)，40目与 100目筛子，油纸，滤纸条(0.5×1.2cm)，干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱(-30℃)，液氮冷冻保藏器。

　　三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点

　　下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。

　　1.斜面低温保藏法

　　将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

　　保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

　　此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。

　　2.液体石蜡保藏法

　　(1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

　　(2)将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

　　(3)用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准(图Ⅶ-12)，使菌种与空气隔绝。

　　(4)将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。

　　此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

　　3.滤纸保藏法

　　(1)将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟。

　　(2)将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

　　(3)取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

　　(4)用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

　　(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

　　(6)将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

　　(7)需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

　　细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

　　4.沙土保藏法

　　(1)取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

　　(2)倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

　　(3)烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

　　(4)另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

　　(5)烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

　　(6)按一份黄土、三份沙的比例(或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

　　(7)抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

　　(8)选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好)优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

　　(9)于每支沙土管中加入约0.5ml(一般以刚刚使沙土润湿为宜)孢子悬液，以接种针拌匀。

　　(10)放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

　　(11)每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

　　(12)若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

　　(13)需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

　　此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。

　　5.液氮冷冻保藏法

　　(1)准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液体的。

　　(2)加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌15分钟。

　　(3)接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

　　(4)冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

　　(5)保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器(图Ⅶ-14)的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

　　(6)恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

　　6.冷冻干燥保藏法

　　(1)准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管(图Ⅶ-15)，大小要求外径6—7.5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0.6—1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟，备用。

　　(2)准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物;酵母需培养3天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养7—10天。

　　(3)制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。

　　(4)冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

　　将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2>)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。

　　(5)真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

　　抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa(0.7mmHg)真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg)，保持压力6—8小时即可。

　　(6)封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管(图Ⅶ-17)继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

　　此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。