细胞转染操作方法全过程

　　转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

　　理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

　　需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。

　　一、细胞传代

　　1.试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

　　2.弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

　　3.用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

　　4.加入1ml的含血清培养基终止反应。

　　5.用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

　　6.将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

　　7.用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

　　8.将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

　　9.将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

　　二、细胞转染

　　1.转染试剂的准备

　　①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

　　②震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡。

　　2.选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

　　3.将混合液在室温放置10―15分钟。

　　4.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

　　5.加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

　　6.到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

　　三、第二次细胞传代

　　1.在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

　　2.再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。

　　3.在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。