气相色谱和液相色谱微型化中的关键问题

　　在色谱仪器微型化过程中,尺寸的缩小不仅要考虑材料的性质和制造上的可能,还要从原理上考虑尺寸缩小后所带来的一系列问题。这些问题包括:(1)分离系统中被分配的分子个数是否大于106,因为只有大于106才能得到符合统计结果的数据;(2)因分离通道尺寸缩小,自然提高了单位柱长的效率,但是总长度的减少可能使总分离效能远低于常规仪器;(3)对于质量敏感型检测器,经过分离柱后单位时间内到达检测器的分子个数是否满足检测原理所要求的最小数目; (4)对于浓度型检测器,到达检测池的分子数目是否能满足符合统计规律的分子数目;(5)检测微区内的外加能量密度是否超过被检测分子所能承受的极限; (6)微量流动相的输送与控制;(7)因材料尺寸的缩小,表面层氧化或腐蚀对器件功能的影响。最后,色谱仪器微型化所带来的好处不仅仅是单位长度分离效率的提高,而是总分离能力的保持甚至提高;不仅仅是分离系统或某个部件的微型化,而是整体的微型化;不仅仅是质量灵敏度的提高,而是浓度灵敏度的保持或提高;不仅仅是能量和物质的低消耗,而是使用的方便和友好;不仅仅是整体尺寸的缩小,更重要的是整机的稳定性和可靠性的提高!

　　下面分别讨论上述7个问题。

　　(1)色谱分离的基本原理是有符合统计规律数目的分子群经过不断的两相分配和分子碰撞,利用其分配系数的差异来达到分离的目的。这是一个宏观参数。当分子数目低于这个数目时,就会偏离统计规律而出现所谓的涨落现象。分子数目越少,涨落现象越严重。当分子数目低于103个时,已没有准确的色谱保留规律,因此也就失去了宏观意义下的分离规律。一般地,保证符合统计规律的分子数目是106个。

　　例如内径30μm的填充毛细管液相色谱 (μ2HPLC)柱或毛细管电泳柱,若分别保持10万/m和40万/m的分离柱效,直接进样时不过载的进样量分别为40pL(1pL=10-12L)和 115pL,分子总数分别是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012。样品中含量低至1～0.01μL/L(对 μ2HPLC)或低至20～0.2μL/L(对CE)的组分就不能满足106个分子的数目要求,分离过程中就会出现上述问题。所以,上述分离系统对浓度高于这个指标的样品分离时可以有重复的保留时间。如果考虑检测方面的限制[参见下述的(3)和(4)>,痕量分析中用粗内径的填充色谱柱总是优于微型色谱柱。

　　为了能进行痕量分析,微型分离分析系统往往采用样品预浓缩技术以补偿浓度灵敏度的不足。但为此而发展的技术也同样适用于常规分离分析系统,同样可以提高常规仪器的灵敏度,除非样品量受到严格限制。

　　(2)45年前的色谱柱理论已经指出,毛细管开口柱的内径越小,或填充柱的填料粒度越小,色谱柱的分离效率就越高。毛细管电泳亦然,只是理论上有些不同,如有散热问题和塞子流型的特点。微型化中普遍采用的细内径分离柱并不是微型仪器的专利,所能达到的高柱效也不是最近才认识到的。如果在现有常规仪器中使用这种等效内径的色谱柱,再适当改进进样技术和检测器,就会有与微型色谱或芯片电泳同样的单位柱长的柱效,同时还可以有极高的总分离效能,因为常规仪器中分离柱的长度很少受限,而高的分离效能才是真正有意义的。所以,微型色谱和芯片毛细管电泳用短分离柱而有快速分离的特点,并不是它真正的优点,因为用同样尺寸的分离柱可以分别在常规色谱和毛细管电泳上实现同样的效果。用现有的思维模式来进行的色谱仪器微型化,导致了使用短分离柱,而且所有的应用例子都是用极简单的样品,这是因为这样的微型化仪器的总分离效能太低。

　　(3)质量型检测器的响应值与单位时间内进入检测器的样品分子数成正比。分离柱的样品容量与柱内径的3次方(毛细管开口柱)或平方(填充柱)成正比。例如气相色谱FID检测器,用内径50μm的毛细管柱只能分析样品中含量为011%(1000ppm)以上的组分;而用内径530μm的毛细管柱能分析样品中含量为3×10-7(013ppm)以上浓度的组分,相差3000 倍。虽然细内径色谱柱的谱带宽度(表现为色谱峰宽度)比粗内径色谱柱的窄,能增加单位时间内的分子数目,但它是与柱径的平方根(本质上是柱效的平方根关系)成正比;与柱容量的减少比,仍然亏215次方。离子化检测器和荧光检测器都是质量型的,离子化效率一般在10-5～10-3,荧光产率一般在 10-3,所以单位时间内进入检测器的分子数目必须大于50×103～50×105,具体数值取决于检测器的性能。用浓度型检测器会极大地改善这种

　　状况,因为响应值主要与目标组分的浓度有关,特殊的质量型检测器,如具有单分子检测能力的激光诱导荧光检测器和热透镜检测器等,已用于CE和μ2HPLC。但是他们绝对不是微型化的设备,也不是一台色谱仪或电泳仪的价格所能买到的。在痕量分析中,用直接进样方式和质量型检测器时,常规色谱总是优于微型色谱。

　　(4)从宏观上讲,浓度型检测器的响应值与进入检测池内样品分子的总数无关,而只与样品分子和流动相分子数的比值有关。例如,用50μm和530μm内径的毛细管柱和池体积为012μL的热导检测器(μ2TCD)检测,最小检出浓度分别为2×10-5(体积分数)和2×10-6(体积分数),仅差10 倍。而后者单位时间内进入检测池中的分子数目比前者多3×103倍。所以微型色谱和微型流动分析仪器中用浓度型检测器有利。但是这个理论是有限度的。如在 CE和μ2HPLC中,当分离柱内径≤75μm、塔板高度≤10μm时,要求检测池体积在nL级(10-8～10-9L),用吸收光谱检测器(浓度型检测器)时,上述理论不再成立。因为从微观看,检测的原理是利用样品分子的某种特性,当分子数目不满足检测原理所要求的统计数目时,表现为噪声信号。所以在上述的微型分离系统中,最小检出浓度是很高的,远不如常规分离系统的低。

　　就检测器本身而言,微型化会影响它的响应灵敏度。如气相色谱用的热导检测器,由于给定气体的热导率与通道的壁间距(d)有关,特别是在d≤015mm时,热导率随d的减小而呈几何增加,因此微型化使热导检测器的灵敏度有大幅度提高。所以,微型化研究应选择那些在原理上有利于保持或提高灵敏度的检测器,或者研究那些有极高检测灵敏度的检测器微型化问题,如激光诱导荧光检测器。

　　(5)检测微区内的外加能量问题。任何检测原理和技术都是依赖样品分子与外加能量的相互作用而产生的物理信号。由于检测微区达到μm级,而作用到微区的光或电磁波强度往往比常规检测器高几倍到几万倍,以此弥补因样品分子数减少而损失的信号2噪声比值。例如,吸收光谱检测器或荧光光谱检测器等常规检测器的光斑直径在500～1000μm,而μ2HPLC或μ2CE的检测器光斑直径仅有30μm,甚至5μm,但所用的光源功率往往是相同的,经过聚焦,达到检测区的光强度提高了3个数量级甚至更高。在这样小的微区内,如此高的光强度会产生如下问题:液体汽化、荧光物质“漂白”、被检测分子变性、响应非线性等。

　　(6)微量流动相的输送与控制。在仪器的微型化中,因为气相色谱的载气流量以 10mL/min到011mL/min计,液相色谱流动相流量以50μL/min到0105μL/min计。特别是液相色谱仪的微流量输液泵,更是微型化的关键难题。用分流的方法解决用常规装置实现微流量调控只是权宜之计;同样,通过改装常规检测器来适应微型仪器也是很牵强的。例如,由于动态密封的微渗漏,现有的机械/电子式气体流量控制阀几乎不能对1mL/min的流量有1%的控制精度;现有的液相高压输液系统也不能对015μL/min的流量有3% 的控制精度。而上述精度都是微型色谱仪所需要的。所以,只有从原理上、材料上、技术工艺上和工程上都重新研究和设计,才能有真正意义上的微型化。

　　(7)因所用材料质量的微小,表面层氧化或腐蚀对器件功能的影响远大于常规色谱仪器。例如热导检测器(TCD)中的敏感热丝,常规的直径在100μm, 而微型化的热敏层厚度仅有几个μm甚至1μm,所以必须解决热敏层老化或腐蚀的难题。再比如微型化的电化学检测器,电极厚度在10-1μm量级,而常规的在102μm量级,两者相差几百倍。所以,微型化的器件必须解决耐腐蚀和老化问题,才能成为实用化的器件,而不仅仅是展品或样机。

　　此外,对于二维分离系统,分离效率决不是简单的第1根柱效(N1)×第2根柱效(N2),而是与柱的选择性有直接关系。当某一对组分在其中一维上不能达到彻底分离时,往往在另一维上的分离度也为零。所以真正有意义的二维分离系统必须是:同系列化合物的目标组分对必须在某一维上达到彻底分离,而不同维担当分离不同族化合物的任务。

　　在设计构思上,微型化不仅是简单尺寸的缩小,其本质上的进步是在解决原理性难题的过程中不断的创新。

　　不论从科学上还是实用上,片面追求分离系统的微小化而忽视检测灵敏度和检测浓度范围的问题;追求单位柱长分离效率的提高和快速检测而忽视实际样品分离对总柱效的要求;追求进样区和分离柱的微小化而忽视其可操作性和检测设备的微型化,是目前微型化研究的误区。从战略上讲,整体微型化的难点问题是分析化学微型化发展的基本难题,虽然有时解决这些问题不是分析化学学科领域的事,但是因为其他学科没有遇到这类问题,致使这些问题成为游离于所有学科的、但是又需要多学科交叉才能解决的科学和技术难题。所以,微型化不是简单的分析化学问题,而是分析化学与材料学、流体力学、电磁学、微加工技术和工艺、电子学、生化和有机化学等学科的交叉,是能够在本质上推动分析化学发展的年轻的学科。