二抗的选择和定位

　　第一步：选择抗体。

　　三种二抗抗体：Whole IgG，F(ab&;rsquo;)2片段，Fab片段。

　　Whole IgG抗体适用于多数情况，是性价比最高的。Whole IgG是完整的抗体分子，有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分 (Figure 1, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc网站)。

　　F(ab&;rsquo;)2片段抗体是胃蛋白酶消化IgG除去Fc部分，剩下靠二硫键连接的结合抗原的两个Fab部分。F(ab&;rsquo;)2片段抗体用在避免抗体与Protain A 或G结合，或者与有Fc受体的活细胞结合。如果一抗是完整的抗体分子，不管二抗是哪种形式都可能结合Fc受体。

　　Fab片段抗体是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。这些抗体只含有一个Fab结合位点。它们用来封闭内源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物种来源的一抗多标记的实验中封闭暴露的免疫球蛋白。

　　第二步：一抗的物种来源。

　　为了正确的选择二抗，必须知道一抗的物种来源。如果一抗是小鼠来源的，就找&;ldquo;anti-mouse&;rdquo;。

　　第三步：选择二抗的物种来源。

　　第四步：选择二抗的特异性。

　　因为不同物种来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，除非事先特殊处理过(如标有&;ldquo;min X Hu, Bov&;hellip;Sr Prot&;rdquo; - minimal cross-reactivity to human and bovine serum proteins) ), 经过用圆括号中的物种 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附处理来降低交叉反应)。在选择二抗时，只有在来自两个很相近的物种的一抗都存在而需要检测其中一种时，才使用针对其中一种特殊吸附处理过的抗体。这样的抗体可能不能和所有亚型的IgG都很好的反应。比如，在含有内源性免疫球蛋白的大鼠的组织样本中，使用针对大鼠吸附处理过的anti-mouse IgG来检测小鼠的一抗，或者在多标记实验中使用了大鼠的一抗时。当不含有大鼠免疫球蛋白时，最好采用没有针对大鼠IgG处理过的anti-mouse二抗来检测小鼠的一抗。牛血清白蛋白(BSA)和奶粉中可能含有牛IgG。直接针对牛，山羊，马和绵羊的二抗会跟牛IgG反应。因此，使用BSA或者奶粉来封闭或者稀释这些抗体可能导致背景染色明显增加，以及抗体效价的降低。这时，推荐使用5%的二抗来源物种的正常血清来封闭。

　　Anti-IgG (H+L)这类抗体和IgG分子的重链和轻链[比如Fc和F(ab&;rsquo;)2/Fab部分]都可以反应。也可以和其他的免疫球蛋白家族(比如IgM和IgA)反应，因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链(&;kappa;链或者&;lambda;链)。Anti-IgG (H+L) 比只抗片段的抗体识别更多的抗原表位。

　　Anti-IgG，Fc fragment specific这类抗体和IgG重链的Fc部分反应。它们通过了ELISA检测，和(或)针对Fab片段吸附的测试。某些情况下，需要额外检测和处理来降低和IgM或IgA的交叉反应，会被描述为&;ldquo;Anti-IgG, Fc&;gamma;fragment specific&;rdquo;。注意：不是所有anti-IgG, Fc抗体和所有亚型的IgG反应能力一致。要找和四种IgG亚类反应能力差不多的anti-mouse IgG, Fc&;gamma;抗体的话，应当选Goat Anti-Mouse IgG (subclasses 1+2a+2b+3), Fc&;gamma;fragment specific (min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)。

　　Anti-IgG，Fc&;gamma; Subclass specific抗体分别和不同的小鼠IgG亚型重链的Fc部分反应。这类抗体经过ELISA和/或针对Fab片段、IgM和其他小鼠IgG亚型的吸附测试。

　　Anti-IgG，F(ab&;rsquo;)2 fragment specific和IgG的F(ab&;rsquo;)2/Fab部分反应。这类抗体经过了ELISA和/或Fc片段的吸附检测。因为和轻链反应，它们同时也和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应(如IgM和IgA)。

　　(min X&;hellip;Sr Prot)这类抗体经过了检测，以及针对IgG和圆括号中的物种的血清蛋白的吸附处理。当其他物种免疫球蛋白的出现可能导致交叉反应时，推荐使用这类抗体。但是，当要选择经过针对相近物种吸附处理的抗体时，要特别注意，因为它们能识别的表位数量大大减小了，可能识别单抗的能力很弱。这种情况的例子有Anti-Mouse IgG (min X Rat,&;hellip;.Sr Prot), Anti-Rat IgG (min X Mouse, &;hellip;Sr Prot), 和 Anti-Ramenian Hamster IgG (min X Mouse, Rat, &;hellip;Sr Prot)。

　　ML (Multiple Labeling多标记实验): 有些抗体标明了ML，来强调它们除了可以用于单标，还可用于多标记实验。

　　第五步：选择需要的探针。

　　第六步：选择的抗体的规格、价钱和目录号。