液相色谱手性制备分离过程中的问题探讨

　　本文拟通过一些具体实例来介绍多糖类手性固定相在高效液相色谱法分离对映异构体中的应用。对多糖类手性固定相类型、手性识别机理、影响手性拆分能力的因素以及制备分离过程中的样品溶解度问题等做了较为详实的阐述与讨论。

　　现实需求：手性药物的不同对映体往往显示出不同的药理学、毒理学及药代动力学性质，出于用药安全性考虑，药品监管部门要求对潜在手性药物的各自对映体必需进行分离和活性(毒性)测试。因此，单一构型手性化合物的获得对于药理和毒理实验的开展是极其重要的。一般可以通过手性合成和手性拆分两种途径来获取单一异构体。各种手性拆分技术中，色谱法因其快速、高效、经济等优势而得到广泛应用。(手性合成方面，请参考相关专著。)

　　案例分析：mg-50g级的单一构型手性化合物各自纯品(即两种构型都需要)。其中之一很可能就是安全有效的候选药物。为了尽快获得各异构体以尽早开展药理、毒理试验，药物发现阶段，许多制药公司都暂缓在不对称合成上的投入，而是敏锐快捷地转向手性色谱分离，迅速地从不太贵的消旋体混合物中分离出高纯度的对映体。手性药物早期开发阶段，不差钱!这时候最要紧的是时间和对映体纯度。时间就是金钱，早期占得先机，后来财源滚滚!

　　解决方案：药物发现阶段，由于手性化合物需求量少(mg-50g级，相对于后期公斤级全面开发及吨位级生产来讲，小巫见大巫。。。)，为尽快尽早获得单一光学纯物质，采用手性色谱制备分离策略。

　　具体方法：拟采用多糖类手性固定相高效液相色谱法(PreparativeChiralHPLC)

　　方法步骤：手性HPLC制备分离对映体，对于某一个具体样品，如何开始chiralHPLC方法建立?对映体在手头上已有商品柱上能否直接分离，是否可以放大等?

　　对于液相色谱法手性制备拆分对映体，其步骤大致如下：1)、了解待分离化合物样品结构信息;2)、选择合适的手性固定相(手性分析柱);3)、对所选的分析柱进行筛选，优化色谱条件;4)将分析条件转移到制备柱上，并对放大分离条件做最后的调整(analyticalchiralHPLC→preparativechiralHPLC);5)、开始制备拆分，若条件允许的话，可以自动进样;6)去除溶剂，回收产品。具体操作起来，可以这么考虑：

　　1)、了解待分离化合物样品结构信息：手性方法建立的第一步为检查待测物的化学结构，尽可能地获取样品的如下信息——在不同溶剂中的溶解度(由于是制备分离，我们期望尽量多的样品溶于相对小的溶剂中。除了分离选择性，样品溶解度通常是建立PreparativeChiralHPLC方法的主要障碍。许多情况下，样品因在流动相中没有足够大的溶解度，因而影响单针上样量，更甚至于沉积于制备柱上而无法洗脱。);形成氢键H-、π键或者偶极相互作用的能力;是否有极性官能团(是否含氨基NH2-、羧基-COOH或者既含酸性基团又有碱性基团);手性中心附近有无大取代基;紫外光谱可否检测等。诸如此类的样品结构信息对预判手性分离能力及手性固定相的选择有较大的帮助作用。

　　2)、怎样选择合适的手性柱：由于手性方法是用于制备分离，在选择手性柱时就应考虑柱容量(柱样品荷载量)。从手性固定相通用性考虑，各商品化的手性柱通用性大致顺序为：多糖柱﹥蛋白柱﹥糖肽柱﹥配体交换柱。

　　多糖类手性固定相基于其独特的分子结构特征在手性分离方面显示出卓越的性能，已经广泛用于各种各样手性分子对映体的分析和制备分离。所以，选定多糖柱作为制备分离用手性柱。

　　3)、手性色谱条件优化：手性液相色谱法，与普通液相色谱类似，方法建立时主要包括手性柱的筛选和流动相条件的优化两个方面。

　　手性柱筛选方面，即便是在选定多糖类手性柱的情况下，由于有多种柱型可供选择，以致于难于确定最好以哪一种柱子开始实验。据已报导的大部分应用研究，Daicel公司“四大金刚”淀粉类ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H和纤维素类Chiralcel-OD-H、ChiralpakOJ-H联合使用可成功分离80%未知样品。但依据个人经验，最英明神武的决策是重用“两大护法”-ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者新型共价键合手性柱ChiralpakIA和ChiralpakIC)，这两者在多糖类手性柱中应用最为广泛，可用于多种结构类型样品的分离。直链淀粉的螺旋结构和纤维素的线性结构，在对映体拆分方面具有手性分离互补特征，ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者ChiralpakIA和ChiralpakIC)配合使用，优势互补，珠联璧合，大大的好。。。

　　流动相条件的优化方面，多糖类手性柱大多在正相模式下分离。方法建立初始阶段，首先尝试在ChiralpakAD-H柱(或ChiralpakIA柱)上，以无水乙醇/正己烷为流动相，通过调整流动相中醇的含量或者改变醇的种类来增强对映体分离选择性。如果只有部分分离或者仍没有分离，可在流动相中添加有机酸、碱等改性剂来优化分离。同时，可以考察柱温对分离的影响。如果发现分离还不理想，再使用另一杀手锏，换用Chiralcel-OD-H(或ChiralpakIC)柱，重复考察前面的各影响因素。若背，喝凉水都塞牙——使用多糖类手性柱未能获得满意的分离度，则另做打算尝试其他类型的手性柱。

　　手性色谱条件优化流程总结如下：

　　4)、分析方法转移：一旦合适的分析条件被确定下来，手性制备分离的第一步旗开得胜，接下来的工作进展就相当地顺利了。一般来说，用于制备分离的填料粒径(20um)要大于以分析为目的的手性固定相粒径(5um)，同时色谱柱的尺寸也有所不同。分析条件转换到半制备、制备规模上来，主要是流速和进样量的调整。制备之前，最好先作“理论分析”(或者凭以往实战经验预判)，接着做小批量的实验逐步证实，放大分离。

　　5)、制备分离：制备手性液相色谱(PreparativeChiralHPLC)，除了在分析型AnalyticalHPLC上摸索分离条件之外，一般来讲，样品的溶解度非常重要。若样品在流动相中没有足够大的溶解度，这使得样品浓度不高因而严重制约单针上样量。多糖类手性柱大多在正相模式下分离，使用醇/正己烷作为流动相体系，等度洗脱。实际应用中，越担心什么偏偏就发生什么，经常会纠结于正相分离模式下样品溶解度不够大的问题。针对样品溶解度问题，具体问题具体分析，特殊情况特殊关照，想方设法提高样品的溶解度。

　　提高样品溶解度的策略：总体原则是——千方百计，想方设法增大样品溶解度，但不改变溶剂洗脱强度或者影响分离选择性。

　　策略一：从样品化合物结构自身入手，通过结构修饰，引入保护基做成衍生物来增强其在有机溶剂中的溶解度。原则是通过衍生物使溶解性变好，且不影响对映体分离选择性或者提高其选择性，同时保护基容易引入和脱除。比如某些类型的手性胺(伯胺和仲胺)，加上一个Boc或者Cbz保护基，溶解性会戏剧性地变好，方便很好地进行分离。

　　策略二：若流动相不能溶解足够量样品，则可以探索不同于流动相的样品溶剂。比如，先用能溶解更多样品的单一溶剂(诸如异丙醇或者无水乙醇)溶解待分离物，然后用流动相稀释，以不析出为度;或者根据样品化合物结构，通过调节pH值或者样品溶剂离子强度的变化来增加样品溶解度，比如溶解样品时，往溶剂中添加一定体积的有机酸(冰乙酸、三氟乙酸)、有机碱(二乙胺、三乙胺)、离子对试剂(甲基磺酸、乙基磺酸)等来助溶，但前提是以不影响化合物的稳定性和对映体色谱分离选择性为准。样品溶剂对色谱分离的影响，可在分析型chiralHPLC上考察，然后转移到制备上。

　　策略三：巧用重迭进样(stackinjection)。我们知道，在RP-HPLC梯度洗脱条件下，进样后，待测物必须完全流出色谱柱后才能进下一针，即进样是间歇式的。但正相模式下的手性分离，等度洗脱，根据样品化合物出峰时间，可以有针对性地选择间歇式的单针进样还是重迭进样(即上一针还未洗脱下来，掐算好出峰时间，把握时机进下一针)。重迭进样(stackinjection)省时增效、节能减排，绿色环保，符合建设资源节约型、环境友好型社会的时代要求。比如某手性制备拆分，若单针进样的话，需要运行32min，两异构体在16.5-30min时间段出峰，前16min时间柱上分离近似于在走基线，同时留意到两个色谱峰16min内能完全流出色谱柱。类似这种情况下，我们就可以考虑使用重迭进样的策略来缩短分离时间，节省溶剂消耗，降低废液排放。

　　6)、回收产品：去除溶剂，这一点与反相制备色谱类同，但手性制备分离是在正相模式等度洗脱条件下进行的，溶剂回收后可以循环再利用，继续用于该分离项目。在实际工作中践行循环经济发展理念，建设生态文明社会。如何确定所得两个异构体的立体构型，R-、S-型洗脱顺序怎样呢?这点可在除去溶剂后，旋光仪测定偏振光方向，正( )还是负(-)，与文献报导值比对，即可确定R-、S-构型。条件优越的话，可使用在线旋光检测器或者圆二色检测器跟踪对映体的洗脱顺序。

　　归纳总结：手性色谱法是最重要的手性分离技术之一，不仅可以快速地测定对映体纯度(对映体过量值)，而且也可以用于制备拆分光学异构体。在众多已商品化的手性固定相中，多糖类手性固定相因分离选择性好、柱容量大而被广泛使用。本文探讨了多糖类手性固定相在制备分离中的应用，快速筛选手性固定相(手性柱)和优化流动相条件(醇等调节剂和改性剂)是成功的关键。同时，样品溶解度是影响拆分速度的一个重要因素。可以与其它较便宜的纯化方法(重结晶、化学拆分法)相结合以降低操作的总体成本。