生物样本冷冻储存技术

　　1 储存温度

　　生物样本的长期储存通常使用尽可能低的温度来降低样本内的生化反应提高样本内各种成分的稳定性。生物大分子、细胞、组织和器官的常用储存温度有-800C(超低温冰箱), -1400C(液氮气相或深冷冰箱)以及-1960C(液氮液相)，温度越低样本的稳定保存时间越长。0～-600C是水的结晶温度，容易对细胞和组织的微观结构造成伤害，一般不使用这一温度来保存组织和细胞。部分经过提纯的生物大分子可以在0～-600C稳定保存一定时间，但在组织样本内生物大分子受到细胞组织内多种因素的影响，稳定性有可能明显降低，所以通常样本库不使用0～-600C作为储存温度。

　　-800C样本储存

　　-800C低于危害性较大的水的结晶温度范围，也是常用设备超低温冰箱能达到的温度，基于操作简便性、储存量和成本等因素来考量，这一温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。但对不同的生物大分子活性这一温度下能保持多久仍无定论。组织中DNA的稳定性可以在-800C下可以保持数年或更长时间。但对RNA来说，则容易被广泛分布于细胞和各种组织里的RNA酶逐渐降解，在不同的细胞和组织中，RNA稳定储存的时间长短也有较大的区别，但一般不超过5年，在一些敏感实验内，RNA在-800C下不到一年就发生了测得出的降解，所以为长期保存RNA活性，建议使用更低的温度，或者利用小部分样本提取RNA与剩余样本同步储存。其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在样本内在-800C下也能保存，但时间长短不一，稳定性逐渐衰减。如果为保护样本里已知的特定生物大分子，也可加入该分子的稳定剂。如果样本里要保存的生物大分子未定，建议使用更低的温度储存。另外目前常见的大型自动化样本存取设备只能和-800C超低温设备配套使用，尚不能够和液氮设备配套使用。英国的UK Biobank则是把一部分样本的拷贝(～950万)储存在-800C做工作样本，使用自动化设备存;另一部分拷贝(～550万)在另外一个地方储存在液氮气相中做安全备份，样本手动存取。

　　-1400C样本储存

　　-1400C是低于水的玻璃化温度(～-1360C)，也是液氮气相和深冷冰箱能够达到的温度，样本在这一温度范围内其生物学活动极大降低，是保存样本中细胞活性的理想温度。和冰水混合物能维持在00C的相变温度类似，绝缘的液氮容器内液相和气相氮应该维持在相变温度-1960C。但实际上由于液氮容器盖子不够密封，从而导致在液氮液面和液氮容器罐口之间形成一个温度梯度。美国国家癌症研究所建议液氮容器口处的温度应保持在-1400C以下，未来用途未确定的样本应以液氮气相模式储存，以保护组织内细胞活性。

　　深冷冰箱是电制冷，无需液氮，装满样品后的稳定温度通常在-140以下，和使用液氮气相相比，其优势在于不需频繁添加液氮，维护方便。但电制冷的降温速度低于液氮，一旦开启容器取放样品时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长，因而更适合较少开启取放样品的情况。另外电制冷冰箱必须保障供电。在断电情况下推荐使用液氮设备以提供备份储存。

　　-1960C样本储存

　　-1960C是液氮挥发的温度，因而只有液氮液相保存技术能达到此温度。样本内的生命活动在此温度下基本停止，样本的稳定性可以得到长期的保存。是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法，得到广泛认可。与其它不同温度冷冻模式相比，液氮容器液相储存样品需要进一步防护样品间交叉污染。美国国家癌症研究所推荐使用带螺旋的冻存管封装样本。但在降温过程中样品从超低温冰箱(-800C)转移到液氮中时骤然降温，引起冻存管帽和管身收缩不一致，容易导致液氮渗入冻存管从而增加了样品间交叉污染的风险。解决的办法之一是可以使用专门的冻存管套对每个冻存管进行热缩密封，或是使用密封膜在冻存管帽与管身接口处缠2-3圈再储存。前一种方法会使管身加长而需要较高的冻存盒，第二种办法会使管身略变粗，推荐使用底部间隔的10x10规格的常规冻存盒。

　　2 冷冻技术

　　上世纪50-70年代Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等学者针对冷冻对细胞和组织的影响展开深入研究，发现损伤主要来源于冰晶损伤和溶液渗透压损伤。随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞壁破坏，从而导致细胞死亡。这种因细胞内部结冰而引起的细胞损伤即冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生脱水渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而形成的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。

　　程序降温/分步降温(programmed freezing/stepwise freezing)

　　通过控制样本的降温速度可以尽量减少冰晶损伤和溶液损伤。降温速度的控制可通过在不同的温度下分阶段降温(stepwise freezing)或者程序控制降温(programmed freezing)实现。与分步降温相比，程序降温仪通过时时调节往冻存空间喷放液氮的流量能更精准地控制样本本身的降温速度。比如在0—-50C液体样本转变为固体发生相变时会产生热量，引起样本的回温，造成样本额外伤害。程序降温仪能够在相变时加大降温力度避免这一伤害。程序降温仪在冻存精子、卵子、受精卵、干细胞、皮肤等样本中得到了广泛的应用，全球大约有30-40万体外受精的婴儿使用了这一方法。一个冻存程序通常包括慢冻、快冻等几个阶段，在冻存保护剂存在的情况下常见的冻存速度慢冻0.3-1.50C/分钟,快冻5-80C/分钟。在0～-400C的区间不少程序使用的是慢冻。但具体的降温程序随冻存样本的不同可能有较大的差别。

　　玻璃化冷冻(Vitrification)

　　玻璃化冷冻的理论首先由Luyet提出。液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列;另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。 正常冷冻时水容易在细胞内形成晶体造成晶体损伤，在细胞外形成晶体造成溶液损伤。但在超快速玻璃化冷冻的条件下细胞内外均呈玻璃化凝固，无冰晶形成或仅形成很小的冰晶，不致对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。但玻璃化冷冻所需要的超的高速降温很难在常规实验条件下实现。1981年Fahy提出用高浓度的冷冻保护液(玻璃化溶液)的方法大大降低了对降温速度的要求，并与1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化冻存，实现这一技术的使用突破。

　　玻璃化冷冻是一种较新的技术，适合用于一些常规程序降温难以处理的样本，比如复杂的组织和器官。但对于常规程序降温能够较好处理的样本(如细胞和体积很小的组织)，这一技术还没有展现出特别的优势。正常的水的玻璃化冷冻需要极快的速度，是常规实验室难以实现的。为了降低组织的玻璃化降温要求，需要在样品中加入高浓度的冷冻保护剂，常用的浓度约在40%～60%(W/V)。即使是几分钟的时间也会对细胞和组织会带来明显的伤害。所以虽然玻璃化冷冻减少了冷冻过程的冰晶伤害和溶液伤害，但在一些对比试验并没有表现出更好的效果，反倒是其复杂的操作带来了不便。目前在玻璃化冷冻中，降低冷冻保护剂损伤的方法主要是使用不同冷冻保护剂的混合物和阻冰剂(ice blockers)。通过这一改进，Twenty-First Century Medicine成功将冷冻并化冻的兔肾移植到兔子体内并保持了正常功能。

　　急冻(Snap freezing)

　　急冻法通常用于保护纯化的生物大分子，或者为了将来提取生物大分子的组织样本。做法是将样本直接放入液氮中，短时间处理之后转移至超低温冰箱或更低的温度环境储存。比较常见的例子是冷冻用于将来提取核酸的组织。这种做法会损伤大部分细胞和精细组织结构，不能用于保存样本内细胞和组织的活性。

　　3 冷冻保护剂

　　冷冻保护剂是指可以保护细胞和组织微观结构免受冷冻损伤的物质，通常配成一定浓度的溶液。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成.同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。通常只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡;而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

　　冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO对细胞的渗透较快，冻存过程中保护效果较好，使用比较普遍，常用浓度是5%-10%。但DMSO本身对细胞有明显的伤害，在40C的温度下伤害尤甚，因此不建议样本添加DMSO后在此温度下长时间放置，通常与程序降温仪或梯度降温盒配合使用实现温度连续匀速降低。

　　非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成;同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

　　不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。