免疫组化染色中“杂音”染色片的种类及解决办法

　　免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。

　　1、全片着色

　　全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

　　(1)抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

　　(2)抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

　　(3)DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

　　(4)组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

　　(5)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4度冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

　　(6)一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

　　2、“阴阳脸”着色

　　指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO(或PAP)笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。

　　3、切片边缘着色

　　切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：(1)组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片(APES或多聚赖氨酸)，切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。(2)切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2 mm。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。

　　4、灶片状着色

　　切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：(1)裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。(2)坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段(如Fc段)可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。(3)制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精(5 ml盐酸+95%酒精95 ml)浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥(室温)、2% APES(2 ml APES+98 ml丙酮)浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮(1-2秒钟)、玻片过一下蒸馏水(1-2秒钟)、37 度过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。

　　5、细胞浆着色

　　胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白(红细胞)、肌红蛋白(肌细胞)、细胞色素(粒细胞、单核细胞)、过氧化氢酶(肝、肾)，这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性(+)到强阳性(+++)，内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干扰。

　　7、细胞核着色

　　不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长(如从星期五浸泡到下星期一)、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的PH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。

　　6、间质着色

　　着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。