暗视野显微镜检查法

　　暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。

　　1、暗视野显微镜的原理和结构特点

　　暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。

　　暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。

　　2、操作方法

　　①使用研究用暗视野显微镜，或将普通光学显微镜上的聚光器取下，换上暗场聚光器。

　　②不论是使用干燥物镜还是油浸物镜，镜检时都应在聚光器的上透镜上加一大滴香柏油。

　　③将制作好的细菌悬滴标本片置于载物台上，上升聚光器至顶部使油与载玻片接触。

　　④放大光源 。

　　⑤进行聚光器光轴调节及调焦。用10*物镜找到被检物像，关小聚光器虹彩光圈至可在视野中看到视场光阑的轮廓，再上下缓慢调整聚光器，这样会使视场光阑的像变得清晰，如视场光阑不在场中央，利用聚光器外侧 的两个调节钮进行调整，当亮光点调到场中央后，再将其开大，即可进行观察。

　　3、注意事项

　　①暗视野观察所用物镜的数值孔径宜在1.00—1.25左右，太高反而效果不佳，最好是使用带视场光阑的物镜，转动物镜中部的调节环，可随意改变数值孔径的大小。

　　②要求使用的载玻片和盖玻片必须无划痕且无灰尘，物镜前透镜也必须清洁无尘。载玻片与盖玻片的厚度应符合标准。载玻片太厚，聚光器的焦点将落在载玻片内，达不到被检物体的平面上;使用油镜头时，由于物镜的工作距离很短，甚至无法调焦，从而看不到或看不清被检物体。

　　③镜检时室内要暗，如果没有这样的条件，应尽可能使用遮光装置，以阻止目镜周围的光线射入。

　　④在进行油镜镜检时，由于油内的杂质和气泡的漫反射，会妨碍视场的镜检效果，所以要求尽可能地除掉油内的杂质和气泡。