显微镜光源及使用要点

　　1.1 光源

　　在很多旧的显微镜书上所提到在理想的照明光源外有一层白色的遮蔽保护，而现在所使用的为电子照明。如果没有完整的照明系统内建在显微镜里，光源通常为一个电网电压玻璃电子灯泡装置在一个简单的外罩里，跟显微镜的镜子一起使用。这一类型的照明并不完全适合在高功率下所使用，因为这一型的照明很大台、会制造大量的热而且只有很低的照明。如果有外部照明使用，外罩就不需要一块收集镜但是光源必需装设一个合适的虹膜光圈或是有不同大小的金属光圈设备。当显微镜使用光源集中模式时，将有适合的场光圈和控制照明的大小。如果有一个可聚焦收集镜安装在外部灯泡，将可以使用科勒照明。一些比较便宜的显微镜装有低功率、低瓦数灯泡，灯泡里头的灯丝设计的较平，将线圈紧密的缠绕在一起而且面对灯泡的玻璃覆盖的末端。这些是提供光来源的延伸。使用这一类型灯泡的显微镜有一片简单的收集镜，通常还有一片放在底面的毛玻璃来提供光的散射。虽然光灯泡是放置在显微镜的基座，照明设备可预先校准且显微镜在光源集中模式下可使用。很多实验用的显微镜有相同的类型的低电压灯泡，放置在前中心平台，此平台可以随着我们所需要去移动，制造出我们所想要的光源。

　　2.1灯丝的分类

　　钨丝灯泡的动力来源主要是经由电压控制变压器。灯泡发散出连续的光谱，从300到1500nm，大部份的能量输出都在长波长的范围里。这表示光有相对低的色温。当照射器的电压上升，照射器的发光及色温也一起很明显的增加。光源的色温在色彩显微照相术里很重要，他的单位为K。

　　传统灯泡的缺点就是他的输出会随着使用的时间而衰减，像钨会从灯丝上蒸发然后冷却凝结在灯泡玻璃内侧使得玻璃变黑。

　　现在很多显微镜都装设卤素灯泡，跟传统的钨丝灯泡相比，当操作在相同的电压下，卤素灯泡有很大的亮度、很高的色温。一些卤素灯泡虽然很小，但是在12伏特之下可输出100瓦的功率。以卤素灯泡来说，在硅玻璃外罩下的灯丝非常靠近，这样可以产生很高的灯丝温度，所以一般的玻璃无法承受这样的温度。卤素灯泡的高灯丝温度可以产生很高的照明。卤素灯泡另一种的特征就是硅玻璃不会随着使用的时间而变黑。这一类型的灯泡即使长时间使用，光的输出很明显的不会改变，然而色温却会随着灯泡使用的时间会有一些减少。卤素灯泡一样发射出连续频谱，当操作在相关的电压下，色温的范围大约是在3200-3250K。由此可裀卤素灯泡一直都在高温下操作，所以在光路径必需装有一片滤热镜，而且卤素灯泡要安装在通风良好的灯屋里。

　　当聚光镜将明场图像聚在样品面上，在工作台下方的聚光镜嵌合口，必须用一些方法将显微镜的光轴导向中央，几乎所有的聚光镜都有光圈在焦平面或靠近焦平面的地方，这种光圈是照光孔径光圈(光圈孔径是适合短工作距离的)，它还限制了NA值，透过聚光镜，使圆锥光线不致于发散而且适合物镜的孔径，在旧的仪器上通常会提供彩色滤光片的嵌合口，以提高对比值，或色彩温度校正。

　　1.3 聚光型式

　　双镜片照明器的聚光镜较常使用在便宜的显微镜，由Ernst Abbe设计，在图6.2a有展示出，这种聚光镜对于色彩和球面像差没有修正，所以不适合用高质量的显微镜，Abbe聚光镜在光圈全开的时候产生圆锥型的光线，所以不会产生敏锐的聚焦(因为球面像差的关系)，而是产生一个多重焦点的混乱区域(显示在图1.13)，这代表由Abbe聚光镜所产生的影像不是那么的清析，而且在周围有彩色的光环(因为此种聚光镜缺少色彩调校)，一个典型的Abbe双镜片照明器，利用’dry’，有最大的孔径约0.5，Abbe最主要的好处是便宜和有很长的工作距离，而且有能力在物体上照亮很大的范围。

　　能得到高校正的聚光镜是比较好的结果，三镜片Abbe聚光镜或等光程聚光镜，有比一般Abbe聚光镜好的球面像差校正，不过仍然对色差没有改善，有一种’dry’NA值为0.65的油涂在载玻片底下，当它的孔径值达到1.2的时候，不管色差，这类型的的聚光镜常用在一般的显微镜上，最贵的无色差/等光程聚光镜(图6.2c)在最少两个波长下适当的染色，当载玻片涂上油，聚光镜可以提供圆锥状的等光程光线，其NA值约为1.4，某些聚光镜为了获得最高的解析，使用高数值孔径且复消色差的浸油型物镜。

　　1.4 光源聚焦

　　控制样品的照明是基本的工作，操控光源照明确保可得到适宜观测结果，这些控制包含有样品的照明及限制样品中所需照明的区域，使光源照只射于样品某区域中使其可见是一个很好的练习，这可减少因散射强光降低图像对比。

　　这几年中，安排照明器及聚光镜方式已满足目前的需求，这老式方法称为”光源聚焦”的照明，在近几个世纪中已使用燃烧的油灯来达到光源聚焦的目的。现今，光源聚焦的照明方式仍广泛的使用于廉价的学生显微镜及利用额外的照明设备观测的业余使用者，像opal enlarger 灯泡这样的均匀光源，直接经由聚焦镜将光源聚于样品面上，而样品中被照明的区域是由位于照明器前方的照明光圈所控制的，一系列的共扼面将使得照明器表面、场光圈及样品聚焦于同一处，致使以上的影像将呈现于视网膜，为了改善这样的情况，照明的设备必需足够大、无明显的结构外型及在照明器表面具有均匀的光强度，当额外的照射光源必需使用时，光源聚焦的照明方式将适合于平常可见的显微镜系统，这样的设置是即简单又容易。

　　大多数近代的显微镜都使用低电压白炽灯或是钨丝卤素灯作为照明设备，由于钨丝照明器具有显著的结构，这使得无法用于光源聚焦的模式;然而，起初用于显微照相术由August Kolher所发明的技术却可用来取代，这是一种将钨丝灯置于集光镜后方之焦距处，而场发光光圈挂载于集光镜前方，如此一来显微聚光镜可将场发光光圈处之影像聚焦于待测样品平面上，然而集光镜只将钨丝照明器影像投射于聚光镜前的焦平面上(也就是光圈虹膜所在位置)，因此照明器的影像将只会出现”光圈图表”的共扼面上，也就表示我们将不会再看到灯丝影像了。在这样的设置中，照明设置中的集光镜如同照射在样品平面上均匀的第二照射光源，这么一来似乎具备了可调整光源大小的均匀照明器;场光圈及样品的影像将会接替出现于”场图表”中的共扼面上，我们称为主要影像平面，并且会成像于视网膜上。

　　对(Kölher)科勒照明而言，照明灯箱必需符合集光镜，通常包含了非球状的组件，这样的集光镜系统必需能具足够的扩大投射白丝灯影像，使得聚光镜的最大工作光圈充满了光源，在Kölher系统中光圈是符合集光透镜的，并作用为场照明光圈，这个动作，第一是为修改物体所受照明区域的直径，由于样品受光学场以外的光影响导致散射光进入物镜中，并且自主要影像周围所造成的光在镜管中散射至目镜，除非我们将场照明光圈影像限制在合适的观测大小范围;第二，当将光圈部份关闭时，这可使得聚光镜完成聚焦动作，并且确认聚光镜置于中心处，当聚光镜聚好焦时，场光圈影像亦同时清楚地显示，如样品影像清晰的位于观测中心。

　　1.5表面照明

　　假如样品太厚导致光线透不过去，如光泽的金属块，或它们的颜色非常深，然后必须用入射光检查其表面，我们通常称表面照明，最简单的型式，用一两个低能量的点照明灯座，在显微镜工作台上方倾斜一个角度，或使用自然光倾一个角度打在样品上，高能量的复合式显微镜对于光的要求必须更为严格，这样才能获得更佳的数据，有表面照明的显微镜，当光由适当的角度射入管子内的光轴，然后经由物镜里半穿透半反射且与光成45度的镜片反射到样品上，在一些较古老的显微镜，可以用简单的方法达到此目的，这种显微镜包含一片很薄的玻璃片，通常这种玻璃类似很小的圆盖玻片，然后在其上部份镀银，另一种不同的方法是使用较小且在背面有焦平面的棱镜，当入射光打到样品上时会有一个小小的斜向角度，以致于物镜的数值孔径会减小，现代的系统使用狭缝光束盒，而且允许全彩的Kohler光来射在样品上，如上面所说的传送光，表面照明也可使用斜向光来应用在明场和黑暗的环境。

　　现代的反射光照明设备接替镜是一个包含了一系列的光学照明系统，这个用灯丝投射影像到光圈孔径平面，这两个的图像靠镜片L2投射到物镜后方的焦平面，这就是传送光系统里的光线收集镜片，我们可以透过开关光圈孔径来控制光通过的量，且不会影响到物镜里镜片的孔镜，同时也顾及到从样品打回来的光，如果光圈孔径完全放在物镜后方的焦平面，这个独立的校正是不可能的。

　　许多应用在生物上的显微镜包括了营光显微镜和共焦显微镜，这两者通常配有表面照明设备，而且发射的光通常都是低强度的且往往都有最大的解析，这种显微术也可用于低反射的物质如煤，这些全部需要物镜片最大的开口值，这个照明场的光圈嵌在里面，所以物镜投射它的影像到样本上，为了减少低反射样品上的辉度，控制好照明场的在表面照明范围的大小比输送光来的重要，值得注意的是，Kohler反射光系统，在相对位置和光圈孔径都与光源相反，光圈孔径开始接近光，因为它不是形容物镜后方焦平面的光圈位置(这样会限制图形的孔径)，光圈被放置在预定的共厄面。

　　2 练习使用显微镜

　　2.1 得到好的影像

　　如果不幸使用质量较差的显微镜，它提供的影像不是我们想要的，正确的架好仪器是非常简单的，而且有能力提供好的影像，如果按照某种简单的规则去调雷射，只需要很短的时间就可以获得高质量的影像，详细研究显镜的样本会花很多时间，这是一个很好的想法，在开始研究之前，我们要先确定椅子够高可以让我们舒服的观看显微镜的目镜，而不需伸长脖子或弯腰，我们可以安置我们的手在工作台上，这可以让我们轻易移动显微镜台也可以容易对焦。

　　显微镜有许多控扭在使用，要在一本书里详细介绍每个操作指令是不可能的，使用者应该咨询其它显微镜的操作手册以了解某操作的特定用法，下面的操作指令提供读者一个广义的概要和使用传送光和Kohler光基本的典型显微镜架设方法。

　　(1) 放置一个高对比的染色样品在工作台上，调整显微镜直到物镜10x或16x的位置上而且打开光，打开所有的光圈，且将聚光镜提升到最高。

　　(2) 假如显微镜是双眼式的，检查目镜管间的双眼距离，必要时需要重新调整。

　　(3) 粗糙的调整聚焦在样本上，这是非常好的做法让第一次物镜在载玻片上5mm处，从工作台的来看。从目镜看过去，增加物镜与样品间的距离直到影像清析为止，做最校正以达到显微镜最好的聚焦。

　　(4) 假如你在使用双眼式显微镜，你必须调整自己适合的目镜模式，最后，目镜必须有自己的校正环，闭上一只眼睛来调整目镜，用另一只眼睛来对焦以取得最佳的影像，再将两只眼睛角色互换，重复上述步骤。

　　(5) 检查光圈孔径是否够宽，部份地靠近光场直到图像呈现在视野里(有时候在中间图像是模糊的)。

　　(6) 调整聚光镜的聚焦使图像和光场光圈合适，如果是Abbe聚光镜，这很有可能使图形带有色彩，不可避免的，等光程和无色差的聚光可以提供影像和光圈场更合适。

　　(7) 如果需要，将图像摆在光圈光场中央，这可以很简单的在视野里让图像倍率和光圈场相符合，在大多数的照明系统设备上包括光圈，在制造的时候就已经用聚光镜中央的旋扭将图形场调到中间，在某些情况下须用自己的旋扭来校正。

　　(8) 打开照明场光圈直到整个视野都照亮为止。

　　(9) 移开其中一个目镜，然后注视物镜后方的焦平面，假如放大镜提供相位对比，对于看清楚焦平面是非常有用的，关掉聚光镜的照明孔径直到图像超出焦平面的光场。

　　(10) 把物镜放回原处，用亮度调整扭调整光的亮度到舒服的程度或在光径加入自然滤片。

　　现在显微镜可以提供它能力范围内最好的图像，假如物镜没有调整的很好，必须关上灯光，重新调整，这比获得良好的影像来的重要，对于旧的镜片，甚至用其它倍率来减少物镜的工作孔径，只有实验经验才是这个情况最好的响导。

　　2.2 较高倍率物境：

　　低倍物镜与高倍物镜最大的不同是后者具较高数值孔径及较大解析，亦指当由较小倍率换至较大倍率时，需将光圈打开已得到较大之光锥角并得到足够的解析。每个物镜应操作在光锥角为数值孔镜的70-90%，否则会使影像不清及出现光晕。调回低倍物镜时亦须重新校正，否则会造成炫光而降低对比。

　　2.3 运用极低倍物镜：

　　应该尽量于低倍率下观测，如此较能使得观测者能连结该影像至肉眼及放大镜影像，只有当所有信息揭取得后方能换至较大倍率物镜，初学者大都很快及运用高倍物镜而导致无法了解物体结构，当用低倍物镜时通常聚光镜无法照亮整个结构，所以必须使用特殊适合的聚光镜。

　　2.4 油镜：

　　用于结构大小约等于物镜分辨率时必须使用数值孔径大于1的油镜，步骤如下：

　　1. 先使用低倍物镜，将物体至于中央。

　　2. 先滴一滴油至盖玻片，若使用近焦物镜，缓慢移动物镜接触油。

　　3. 调整焦距至影像清晰。

　　4. 确认聚光镜的光圈是打开的，此时聚光镜的最大使用数值孔径是1.0，故光锥角是绝对不够的，需使用特别的高数值孔径聚光镜。

　　最好的结果是只有要观测样本的部分需要被照明，当倍率增加时，照明的范围亦须减小，否则炫光会影响影像，特别是反射式。另一种影响影像的是泡泡，当目镜移去时可看到，可利用前后移动或旋转玻片去除泡泡的影响，当如此都无法去除时就要重滴一滴油。

　　2.5 暗视野：

　　暗视野是用来增加对比的很有价值的技术，而且简单。此处提及暗视野基于其简单且常受显微学家的重视。在低倍率时通常在阿贝聚光镜中央置一不透明之黑点，在高倍率时则需要特别之暗视野聚光镜，且须于下方与玻片的油接触，且须特别对准中心，一些暗视野聚光镜中央有一圆圈以帮助定位。先移去玻片，将该黑点或圆圈对于视野内，换上玻骗且将聚光镜接触玻片下方，最后调整聚光镜的焦距直到见到最佳的暗视野影响，即物体明显显示于黑的背景下。在缺乏暗视野聚光镜的时候可将滴倍率物镜对焦于玻片，接着将聚光镜对准该点，调整聚焦点为一视野内的亮点，接着换上高倍率物镜作最后调整，注意当使用阿贝聚光镜时需将光圈全打开以使周围的光皆能通过，反射式暗视野并不适用光圈。

　　当使用暗市也技术时须注意所有光学路径必须维持干净，任何额外的物质会明显影响影像。

　　2.6 反射镜或上照明：

　　当物体为不透明时需用反射式，使用低倍显微镜及一般配件即可，因低倍物镜工作距离较常可以光点在样本上对焦，这样的照明可能会偏离光轴但可提供较佳的轮廓，当需要用到较高倍率物镜时便需用到柯勒照明，炫光通常会较穿透式严重故需小心调整，反射镜安装于后共焦面，在一些简单的装置上反光镜可能只是简单的玻璃，有十一个小的镜片会装于光轴上但会限制最大光圈，现代的设备会基于柯勒原理而使用一分光管或内建的光学照明系列。

　　2.7 调整灯：

　　当使用柯勒照明时灯式必须有一收集片，必须小心调整灯丝影像于聚光镜的光圈，此时需暂时关上聚光镜光圈。在一些内建光源的显微镜可调整灯泡于光轴，如果没有在灯泡后有镜子及磨沙玻璃于集光镜，可藉由放一磨沙玻璃或白卡至聚光镜焦距上则可看到灯丝，该平面可轻易于聚光镜处以一镜子摆为45度时看见。

　　如果使用显微镜次座台镜作为外部光源之柯勒照明，灯丝的影像必须聚焦于聚光镜光圈下方的灯室聚光镜，利用一个小型的手持配镜即可轻易看见。

　　2.8 设定来源聚焦光源

　　此方法通常用于显微镜装有镜子及外部光源，灯泡应装于具有限制灯泡面积的灯室，他可能是可具有可调之光圈组，且此光圈组需尽量靠近灯泡，灯泡本身则必须光线充足及均匀，并足以照明低倍率时的整个视野。一般所谓的珍珠灯泡则不适合，应他会在视野中央形成 一亮点，用于放大相片用的乳白灯泡则非常适用。显微镜的设定步骤如下：

　　1. 调整灯泡和显微镜，将灯泡至于距离显微镜200-250mm，调整灯室角度并将光圈开至最大。

　　2. 放一适当的样品至观测台，并使用10倍物镜，通常此时不论光源是否有调整好，都应该有足够的光。

　　3. 调整显微镜的镜子及灯泡至最佳亮度

　　4. 缓慢移动镜子，会看见模糊的视野边缘，接着调整聚光镜直至边缘影像清晰，因为典型的阿贝聚光镜的消色差能力不佳，有可能会见到光晕，如果场光圈不适当则可能要调整灯泡聚焦至样本平面，一笔尖放置灯泡表面可帮助对焦。

　　5. 减小光圈至光源指照亮样本。

　　6. 调整聚光镜下的光犬以取得适当工作光圈。

　　7. 如果必要可跳整镜面角度，使用强度率光镜及彩色率光镜。

　　2.9提高对比

　　虽我们已经强调过了一个影像的处里是否能够清楚取决于有没有足够的对比是很重要的所以在这一章节我们将介绍对比对于光学显微技术是很重要的就像darkground,phase contrast ,differential interference contrast ,等技术都是为了提高对比而发展出来的技术详细的说明在Bradbury Evennett(1996)有详细说明若我们有一个对比不高的样品我们要用简单的方法来提高对比若我们有一个物镜他有自然的颜色或有被染色过就可以用滤镜来加强对比若有一张黑白照片我们一用滤镜去补偿的话就可以提高对比又如一样品我们把他染红绿色在经过绿滤镜补偿之后红色部分就会变的很暗反之原理亦相同宽带的时域穿透率竟是用玻璃或塑料做成的其它重要的滤镜如color correction filter,neutral filter,heat fitter color correction filter用来抑制钨灯所产生的红黄的过剩光线light blue filter有时可利用他来用肉眼去看会更清楚nd filter是用来衰减强度的若必须要用高功率的光源这一个滤镜就是最常用的率降来衰减强度用的千万不要只靠着关闭孔镜或改降低光员工率若高强度的灯如钨卤素灯则热滤镜就会被用到他可以用来吸收由样品所生的红外放射光

　　2.10

　　当有一个影像差的情形出现时照着7.2来操作就可以改善

　　2.11仪器的注意

　　再显微镜的仪器通常是贵重的所以再举起时均要小心并且保持仪器在最好的状态如何保护仪器通常预防好于治疗千万不可以用不是当的螺丝起子再移动物镜或目镜时均要注意是否会撞到平台或其它东西。