多肽激素标志物酶联免疫

　　CSA法和改进CSA法的敏感性和存在的问题

　　提高IHC敏感性有几种途径。一是依靠各种IHC的前处理，例如酶的消化、高温的抗原修复，虽然对其的基本原理不十分清楚，但却十分实用;其次是增加IHC方法的放大倍数，主要是酶结合量的增加。例如EnVison法，一个EnVision葡聚糖多聚物结合100个左右的酶分子和15个抗体分子，要比二步法S-P(LSAB)上结合的酶分子多许多倍。

　　虽然EnVision法的敏感性大大提高，方法也简便，但其大分子对于核内抗原的定位就不如LSAB法，存在穿透核膜困难的问题。因而，有时EnVision法就不如LSAB法敏感，尤其是活细胞核内抗原定位更为困难。CSA法的应用，既克服了LSAB法敏感性不高的缺点，又保留了较好的细胞穿透性。

　　已有的研究结果证实(Hasui K，2005;倪灿荣等，1999)，CSA法较LSAB法敏感500—1000倍，较EnVision法敏感20～100倍。其对细胞周期素等核内抗原的定位，有独特的优点，定位准确性、敏感性、稳定性要较标准的CSA法好，其敏感性和穿透性要好于EnVision法。

　　最近，Hasui K等(2005)的研究结果表明，CSA法具有很高的敏感性的同时，也存在严重的内源性物质干扰(内源性生物素、内源性过氧化物酶、第一抗体与组织细胞内的不明物质的非特异性结合)，尤其是经抗原热修复后情况更为严重。作者应用标准的EnVision法、CSA法和改进(加阻断剂)的CSA法检测淋巴结、正常肝、肝细胞癌、胃肠道鳞癌及癌周正常组织中k167抗原，其检测最佳效果的标准流程如下。

　　(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3x3min。

　　(2)首先用0.3%过氧化氢甲醇破坏内源性过氧化物酶的活性，室温20min。

　　(3)PBS洗3x3min。

　　(4)抗原修复，室温冷却20min。

　　(5)PBS洗3x3min。

　　(6)第二次用0.3%过氧化氢PBS破坏内源性过氧化物酶的活性，室温5min。

　　(7)用温的(35℃)TBST[0.02mol/L(pH7.8)Tris—HCl+NaCl+0.1%Tween20]洗3x3min。

　　(8)滴加蛋白阻断剂(0.25%酪蛋白)，以阻断第一抗体的非特异性结合位点，10min，不洗。

　　(9)滴加适当稀释的第一抗体(在S-P法基础上5—10倍稀释)，或4℃过夜。

　　(10)PBS洗3x3min，温的(35℃)TBST洗3x3min。37~C孵育15～60min，

　　(11)滴加蛋白阻断剂(0.25%酪蛋白)，以阻断多聚物试剂的非特异性结合位点，lOmin，不洗。

　　(12)多聚物(EnVision)孵育15min，温热(35℃)TBST洗3x3min。

　　(13)滴加蛋白阻断剂(0.25%酪蛋白)，以阻断CSA试剂的非特异性结合位点，10min，不洗;如用荧光素标记酪胺需用TBST洗3次。

　　(14)用生物素标记酪胺孵育15rain;如用荧光素标记酪胺孵育15～30rain。温热(35~C)TBST洗3X3min。

　　(15)链霉亲和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP标记的抗FITC抗体孵育30rain，温的(35℃)TBST洗3X3min。

　　(16)0.04%DAB(含0.03%Hz02)显色5～10min。

　　(17)复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。