植物病原真菌的分离培养

　　一、实验原理

　　植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

　　二、实验目的

　　植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

　　三、实验材料及准备

　　1.分离材料：梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)，柿树圆斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新发病的病叶;杨树烂皮病(Cytospora chrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorella sp.)的带有新病斑的枝条;油松种子。

　　2.分离用具(每小组为单位)

　　酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿(Φ9cm)24套，小烧杯(5ml)4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶(60ml)1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

　　四、实验方法及步骤

　　(一)分离前的准备工作

　　1.工作环境的清洁和消毒

　　分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。

　　2.分离用具的消毒

　　凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次(刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火)。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。

　　3.分离材料的选择

　　用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

　　(二)植物病原菌的分离

　　1.叶斑类和枝杆病斑类(非维管束侵染)病原菌分离

　　首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：

　　①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。(为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴)。

　　②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下(若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但)。

　　③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。

　　④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。

　　⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿4——5块，排放均匀。

　　⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25℃

　　⑦3-4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。

　　2.种子内病菌的分离

　　将整粒种子或种子的一部分进行冲洗，再经表面消毒(升汞或漂白粉)，最后用灭菌水洗涤后移到人工培养基平板上培养(或者直接放在皿内保湿培养于25℃温箱中)。

　　3.危害输导组织病原的分离(以枯萎病为代表)

　　先将分离茎作表面消毒，然后用灭菌刀剥去表皮，剪取其中小块变色的维管束组织，再用漂白粉进行表现消毒后，移于培养基平面上培养。

　　4.分离物的纯化

　　前述方法获得分离物，必须经过纯化，才能成为培养，纯化的方法有单孢子分离法和边续稀释培养法两种，后者简便，为了一般研究所常用。

　　连续稀释法：对真菌材料来说，就是从典型菌落边缘切取含有菌丝的培养基一小块，移植于另一培养基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。如此数次，直至菌落形态典型，无杂菌时即可移入斜面试管中培养保存。

　　附：

　　1、0.1%升汞液的配制：升汞1克，浓盐酸2.5毫升;加水1000毫升。注意要先将升汞用盐酸溶解，然后加水稀释。

　　2、P.D.A培养基成分;马铃薯200克，葡萄糖10-20克，洋菜17-20克，水1000毫升。

　　3、水洋菜培养基成分，洋菜17-20克，水1000毫升。