免疫组化技术要点和常见问题

　　在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片(已知的高表达相应抗原的组织)和阴性对照组织片(不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组)，所有操作过程应完全一致。

　　染色弱或者没有染色(按照先后顺序，先排除一些简单的原因)：

　　试剂使用顺序错误或者漏加试剂重复实验，保证每一步均正确

　　二抗和一抗不匹配选择匹配的二抗

　　底物和酶不匹配选用匹配的底物

　　酶失活换用新的酶(将酶和底物混合，看是否显色?)

　　组织中没有待测抗原表达或者表达水平低使用阳性对照片

　　抗体浓度太低增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度

　　抗体孵育时间不充分延长抗体孵育时间

　　底物孵育不充分延长底物孵育时间

　　抗体储存不当，导致失效将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。或者根据说明书进行恰当的保存

　　一抗失效换用新的一抗

　　二抗失效换用新的抗体(能否成功与其它一抗配合?)

　　脱石腊不充分延长脱腊时间或者换用新的二甲苯

　　组织固定不充分或者不当增加固定时间或者改用不同的固定方法

　　组织固定过度减少固定时间。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法

　　复染试剂与底物系统不匹配选择正确的复染试剂(不加复染剂，看是否有组织染色?)

　　封片剂不正确选择正确的封片剂

　　染色背景高：

　　可能原因解决办法

　　洗片不充分每步之间至少洗片3次

　　组织含有内源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3%的H2O2甲醇封闭内源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统

　　组织含有内源性生物素(尤其是肾脏、肝和脾)在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色?)

　　一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高增加一抗的稀释度

　　二抗和组织非特异性结合使用与二抗来源相同的正常动物血清(一般是10%)封闭，必要时可以将血清浓度加大

　　组织固定不充分，抗原扩散Increase duration of postfixation

　　使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂

　　干片染色过程中避免出现干片现象

　　染色强度过大：

　　可能原因 解决办法

　　一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度。或者使用不同的浓度，决定最佳染色浓度

　　孵育时间过长减少孵育时间

　　孵育温度太高降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者RT

　　底物孵育时间过长减少孵育时间

　　干片染色过程中避免出现干片现象