过氧化氢酶测定步骤

　　过氧化氢酶

　　测定步骤：

　　(1)SOD提取：

　　称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)

　　(2)除杂蛋白：

　　提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。(取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)

　　(3)SOD酶的沉淀分离：

　　剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。

　　(4)粗酶液活性测定：

　　提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。

　　加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。

　　试剂/(mL)

　　空白管

　　对照管OD1

　　提取液OD2

　　粗酶液OD2

　　酶液OD2

　　PH8.3缓冲液

　　3

　　3

　　3

　　3

　　3

　　SOD提取液

　　0

　　0

　　0.1

　　0.1

　　0.1

　　蒸馏水

　　2

　　1.8

　　1.7

　　1.7

　　1.7

　　室温放置20min

　　邻苯三酚

　　0

　　0.2

　　0.2

　　0.2

　　0.2

　　(5)溶液中可溶性蛋白含量测定：

　　分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。

　　提取液稀释：50 ×

　　粗酶液稀释：20 ×

　　酶液稀释：10 ×