细胞爬片的免疫组化染色的操作步骤

　　1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分钟

　　2. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

　　3. 打孔液浸泡 5 分钟。

　　4. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

　　注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

　　5. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理，37℃，15 分钟。

　　附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

　　6. 滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

　　7. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　8. 滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

　　9. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　10. 滴加三抗 (SAB 复合物) ，37℃，40 分钟。

　　11. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　12. DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。

　　附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

　　13. 自来水(细水)充分冲洗。

　　14. 苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

　　15. 自来水冲洗返蓝，15 分钟。

　　16. 梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

　　17. 二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟

　　18. 封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。