检测蛋白磷酸化的方法

　　蛋白激酶将磷酸基团从ATP转移到蛋白多肽底物上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，直接影响目标的活性和功能。放射性研究表明，真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。这一关键的翻译后修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。在评估磷酸化时，选择的方法可能会有所不同，这取决于多个因素，包括提出的具体问题以及特殊仪器或试剂的可用性。如何检测蛋白磷酸化，本文简要介绍了几种常用方法，并提出了每种方法的优点和缺点。

　　激酶活性分析

　　蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，它们影响了众多负责生物反应的下游效应物，因此，评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。此外，R&D Systems还提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能够定量任何可产生ADP的激酶的活性。尽管我们能够获得有关特定激酶行为的信息，但评估细胞提取物中的酶活性仅仅揭开了信号通路的冰山一角。我们对蛋白如何被修饰还知之甚少，且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。磷酸化蛋白的直接检测可能为细胞如何应对外界刺激提供更详细的分析，因为磷酸化肽段的鉴定为蛋白的表达和功能状态提供信息。

　　磷酸化特异抗体的开发

　　直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。

　　鉴于这些方法很费力，磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。1981年，第一个有记录的磷酸化抗体在兔子中产生，使用的是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸结合物。这一抗体广泛地识别了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子，开发出多个磷酸化状态特异抗体，这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中，产生高度特异的免疫试剂。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在任何技术中使用磷酸化特异抗体的忠告是，成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。

　　Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，大部分细胞生物学实验室都拥有开展这些实验的设备。利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Western blot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。许多磷酸化特异抗体十分灵敏，可轻松检测常规样品(如10-30 µg细胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。

　　酶联免疫吸附分析(ELISA)

　　ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。ELISA的定量能力优于Western blot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。ELISA通常带来了激酶活性的间接测定。不过，另一类ELISA技术使用固定化的捕获抗体、底物和磷酸化底物的检测方法，带来激酶活性的更直接测定。