一抗的选择与优化

　　在设计IHC/ICC实验时，一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化，以便观察到特异染色，并尽可能减少非特异的背景染色。这包括开展预实验，以确定每个一抗的适当孵育条件。抗原亲和纯化的多克隆抗体的稀释度通常低于单克隆抗体，但这些值必须根据经验确定。为了获得可靠特异的信号，应采用交叉反应性极少的高质量抗体。

　　一抗孵育的起始条件

　　单克隆抗体多克隆抗体

　　组织5-25 µg/mL，4 °C孵育过夜1.7-15 µg/mL，4 °C孵育过夜

　　细胞5-25 µg/mL，室温下1小时1.7-15 µg/mL，室温下1小时

　　优势 单表位特异性所需浓度较低

　　限制 易受表位遮蔽的影响异质群体

　　选择一抗供应商

　　在搜索一抗时，产品很可能有几个不同的商业来源，而它们的抗体质量可能参差不齐。最初的选择也许决定了这是个成功的实验，抑或是个错失的机会。第一步是寻找独立验证。这包括在文献中检查抗体过去是否成功使用。许多供应商(包括R&D Systems)都可以为寻找这一信息的研究人员提供协助。另一个问题是询问抗体是否真的由供应商制造，还是它采购了之后转售?直接购买确保了商业来源对制造、质量控制流程、以及运输和储存条件的完全控制。此外，一旦抗体的使用出现问题，制造商会处于提供优质技术服务的最佳地位。

　　选择单克隆还是多克隆抗体

　　单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生，代表了同质群体，能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用，因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

　　抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构想状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的，可识别多个表位，因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言，多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因，多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。

　　多克隆抗体的亲和纯化

　　多克隆抗血清是抗体混合物，它们由大量B细胞克隆产生。组成多克隆抗血清的抗体以不同的特异性和亲和力与目标表位结合，也与不相关的目标分子交叉反应(非特异相互作用)。为了富集与目的抗原特异性和亲和力最高的抗体，R&D Systems的多克隆抗体经过抗原亲和纯化。在此过程中，多克隆抗血清流过包含固定化抗原分子的亲和柱。特异抗体被固定化抗原保留，而非特异抗体流过柱子，被丢弃。随后从柱子上洗脱经抗原亲和纯化的抗体。抗原亲和纯化的抗体主要与目的抗原相互作用，降低了背景染色，与未纯化抗体相比产生了更一致的结果。

　　一抗孵育的优化

　　一抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响了染色质量。这些变量需要针对每个抗体和样品来优化，以便实现特异染色和低背景。优化通常是保持孵育时间和温度不变，而改变抗体浓度，以确定何时获得最佳信号和低背景噪音。例如，如果使用高亲和力的抗体，那么相对较高的浓度可能需要较短的孵育时间。相反，较低的抗体浓度可能需要较长的孵育时间。人们通常采用较长的孵育时间，以确保抗体完全渗透到体视学技术所用的组织切片。为了促进特异染色，较长时间的孵育通常在低温下开展(即4 °C vs 室温)。

　　R&D Systems组织切片染色方案的优化通常是从一抗在4 °C孵育过夜开始的。对于细胞染色，人们通常选择在室温下与一抗共同孵育1小时。抗原亲和纯化过的多克隆抗体的工作浓度(1.7-15 µg/mL)通常比单克隆抗体(5-25 µg/mL)要低。在比较不同浓度的相同抗体染色的样品时，在孵育步骤时必须使用一致的时间和浓度。当第一次使用新抗体时，建议开展预实验，检验各种抗体浓度。