蛋白酶活性的测定方法

　　1　原理

　　蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钨兰和钨兰混合物)。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

　　2　仪器和设备

　　2.1　分析天平：精度0.0001g

　　2.2　恒温水浴：精度±0.2℃

　　2.3　计时表

　　2.4　分光光度计

　　2.5　沸水浴器

　　2.6　振荡混合器

　　2.7　pH计: 精度0.01pH单位

　　3　试剂和溶液

　　3.1　乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶

　　甲液：称取乳酸(80%-90%)10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

　　乙液：称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000ml.

　　使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

　　3.2　磷酸缓冲液的制备(pH=7.5)适用于中性蛋白酶

　　准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO3.12H2O)6.02和磷酸二氢钠(NaH2PO3.2H2O)0.5g,加水定容至1000ml

　　3.3　硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶

　　甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

　　乙液： 称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.

　　使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

　　3.4　0.4mol/L碳酸钠溶液：

　　准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.

　　3.5　0.4mol/L的三氯醋酸液：

　　准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml

　　3.6　0.5mol/L的NaOH：

　　准确称取2g NaOH溶解并定至100ml

　　3.7　10.00mg/ml酪素溶液

　　称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.

　　3.8　100μg/ml酪氨酸标准溶液

　　3.8.1准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

　　3.8.2吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.

　　3.9　酶样的制备

　　准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。

　　4　分析步骤

　　4.1　标准曲线的绘制

　　L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

　　试管号 0 1 2 3 4 5

　　取 100 μ g/ml 酪氨溶液( ml ) 0 1 2 3 4 5

　　蒸馏水( ml ) 10 9 8 7 6 5

　　酪氨酸实际浓度(μ g/ml ) 0 10 20 30 40 50

　　4.2　分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。

　　4.3　样品测定：

　　4.3.1先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min

　　4.3.2取4支试管，各加入1ml酶液

　　4.3.3取一支作为空白管，加2ml三Chloroacetic acid，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min

　　4.3.4取出试管，3支测试管中各加入2ml三Chloroacetic acid，空白管中加1ml酪素。

　　4.3.5静置10min，过滤沉淀

　　4.3.5各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的 Na2CO3 5ml、福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。

　　注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。

　　5. 计算

　　5.1 酶活定义：

　　1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5)条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。

　　5.2 计算酶的活性单位依据以下公式

　　蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml)

　　A：样品平行试验的平均OD值

　　K：吸光常数

　　4：反应试剂的总体积

　　10：酶解反应时间

　　n：酶液稀释总倍数