人凝血酶怎么制备

　　人凝血酶(human thrombin)是1种丝氨酸蛋白酶，主要功能在于将可溶性的纤维蛋白原水解成不溶性的纤维蛋白，因此在止血和凝血、组织修复和创伤愈合等方面有重要作用[1，2]。正常情况下，人血液循环中的凝血酶以非活化的形式存在，即凝血酶原，通过水解酶作用，主要转换成具有活化形式的α凝血酶，此外还有β和γ凝血酶[3]。α凝血酶在凝血酶中含量>97%，由1条3 kD的轻链和另1条31 kD的重链通过二硫键连接而成，具有广泛的生理学活性，如水解纤维蛋白原形成纤维蛋白凝块，参与凝血因子Ⅴ和Ⅷ的激活，通过激活因子起到稳定纤维蛋白的作用，在凝血酶原激酶作用下起到激活蛋白C的抗凝血作用;此外，它还通过激活血小板上的凝血酶受体来刺激血小板的聚集[4]。由于凝血酶在止血与凝血、组织修复等方面起到极大的作用，已成为国内外研究的焦点。我们现就人凝血酶的制备技术、病毒灭活及相关应用研究综述如下。

　　制备技术

　　1.1 固定化肝素亲和层析 Nordenman等[5]将固定化肝素的琼脂糖凝胶用于人凝血酶的分离纯化，从电泳结果可知该方法制备的人凝血酶纯度较高。国外有研究者以新鲜血浆做原料，经蛇毒激活凝血酶原和肝素Sepharose CL6B亲和层析柱后，1 L血浆可获得纯度>97%、比活性为4 600 IU/mg的α凝血酶25 mg[6]。陈红兵等[7]通过凝血酶原提取、激活和肝素Sepharose CL6B亲和层析等步骤，从枸橼酸盐抗凝血浆中分离出回收率为87%，比活性达到4 715 IU/mg的人凝血酶。这些报道表明，用肝素亲和层析分离人凝血酶，不仅可获得高纯的制剂，同时可简化制备步骤和缩短分离纯化时间。但是由于亲和凝胶价格昂贵，到目前为止尚未用于凝血酶的大规模制备。

　　1.2 离子交换层析 近年来，由于具有快速、选择性好及特别适于大体积样品纯化等优点，离子交换层析在人凝血酶的分离纯化中得到广泛使用。Zhigniew等[8]用SPSpherodex阳离子交换层析对富含凝血酶的原料分离纯化，结果表明该类交换剂对凝血酶有很好的选择性，纯化后的牛凝血酶和人凝血酶的酶活力分别达到2 300和1 150 IU/mg，2种凝血酶的回收率都达到了70%—90%。孙文种等[9]用CMSepharose阳离子交换层析从Nitschmarm组分B中分离凝血酶，经分离后凝血酶比活为195 IU/mg，回收率77.9%。Catherine等[10]以冷沉淀上清为原料，先用DEAEsephadex A50 吸附得到57.5 IU/ml凝血酶原复合物，然后用CaCl2激活获得345 IU/ml的凝血酶，并将凝血酶上SPSepharose F.F.阳离子交换柱，最终得到凝血酶的比活性为1 150 IU/mg。安康等[11]为从Cohn组分Ⅲ中获取人凝血酶，依次用PEG沉淀、DEAEsephadex A50离子交换层析和SPSepharose F.F.层析等步骤，最后制得纯度和比活性较高的制品，现已上市。Amal等[12]以凝血酶原激酶激活的富含凝血酶的血浆上清为原料，用DEAESepharose阴离子交换剂做初步纯化后，进一步用CMSepharose阳离子交换分离，制备出超高纯的凝血酶，其凝血酶的比活性为(9 200—12 650)IU/mg。由于离子交换层析具有操作简单，耗时短，成本相对较低等优点，使得凝血酶规模化生产成为现实。

　　1.3 多重色谱层析联用 从已有的文献报道来看，制备人凝血酶的原料有冷沉淀上清、Cohn 组分Ⅲ和凝血酶原复合物等;但这些原料中除了人凝血酶原外，还含有具有治疗意义的其它血浆蛋白，如FⅨ、蛋白C，采用单一原理层析法制备人凝血酶时，无法使这些有益成分得到综合利用。为此，国外有公司根据各血浆蛋白的理化性质的差异，采用不同原理的色谱联用方法来分离纯化凝血因子。以冷沉淀上清为原料，分别采用DEAE阴离子交换层析、HeparinSepharose F.F.亲和层析和金属螯合层析分离出凝血酶原和FⅨ，将凝血酶原激活后，再用疏水层析纯化出人凝血酶。此方法不仅能制备出高比活性的凝血酶，而且能同时分离出其它的凝血因子(如FⅨ)，所制备的凝血酶比活性为2 400 IU/mg，远高于Baxter公司的Tisseel制品(7.5 IU/mg)和OMRIX公司的Quixil制品(184 IU/mg)，而且这样的生产工艺可整合生产流程，降低生产费用，最终达到提高血浆蛋白的利用率的目的。但就目前来看，该分离方法存在生产工艺复杂、成本过高等缺点，短期内鲜有规模化生产的可能。