凝胶迁移实验

　　1.探针的标记

　　(1) 如下设置探针标记的反应体系：

　　待标记探针 (1.75pmol/微升) 2微升

　　T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升

　　Nuclease-Free Water 5微升

　　[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升

　　T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升) 1微升

　　总体积 10微升

　　按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀.

　　(2) 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟.

　　(3) 加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应.

　　(4) 再加入89微升TE,混匀.此时可以取少量探针用于检测标记的效率.通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上.为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率.

　　(5) 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天.标记好的探针可以保存在-20℃.

　　2.探针的纯化

　　通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针.在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果.如需纯化,可以按照如 下步骤操作：

　　(1) 对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀.

　　(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜.

　　(3) 在4℃,12000g-16000g离心30分钟.小心去除上清,切不可触及沉.

　　(4) 在4℃,12000g-16000g离心1分钟.小心吸去残余液体.微晾干沉淀,但不宜过分干燥.

　　(5) 加入100微升TE,完全溶解沉淀.标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天.标记好的探针可以保存于-20℃.

　　3.EMSA胶的配制

　　(1) 准备好倒胶的模具.可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具.最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作.为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具.

　　(2) 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大).

　　TBE buffer (10X) 1毫升

　　重蒸水 16.2毫升

　　39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升

　　80% 甘油 625微升

　　10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150微升

　　TEMED 10微升

　　(3) 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中.避免产生气泡, 并加上梳齿.如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理.

　　4.EMSA结合反应

　　(1) 如下设置EMSA结合反应：

　　阴性对照反应：

　　Nuclease-Free Water 7微升

　　EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升

　　细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升

　　标记好的探针 1微升

　　总体积 10微升

　　样品反应：

　　Nuclease-Free Water 5微升

　　EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升

　　细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升

　　标记好的探针 1微升

　　总体积 10微升

　　探针冷竞争反应：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升

　　细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升

　　未标记的探针 1微升

　　标记好的探针 1微升

　　总体积 10微升

　　突变探针的冷竞争反应：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升

　　细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升

　　未标记的突变探针 1微升

　　标记好的探针 1微升

　　总体积 10微升

　　Super-shift反应：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升

　　细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升

　　目的蛋白特异抗体 1微升

　　标记好的探针 1微升

　　总体积 10微升

　　(2) 按照上述顺序依次加入各种试剂 ,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应.然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟.

　　(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样.注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液.如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可.

　　5. 电泳分析

　　(1) 用0.5XTBE作为电泳液.按照10V/厘米的电压预电泳10分钟.预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行.

　　(2) 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内.在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色),用于观察电泳进行的情况.

　　(3) 按照10V/厘米的电压电泳.确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压.电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳.

　　(4) 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸.小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液.小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧.滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来.把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡.

　　(5) 干胶仪器上干燥EMSA胶.然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测.