动物细胞培养：细胞冻存与复苏

　　细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于一196~C液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。

　　材料：冻存管，离心管，细胞培养用材料，500 mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75%酒精棉。

　　药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0.25%胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜(DMSO)或甘油，0.5%台盼蓝染液，液氮。

　　仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。

　　(一)细胞冻存

　　1.取待冻存的细胞用胰酶消化(见相关实验细胞传代培养部分)，用培养基将细胞冲洗下来。800 r/min离心5 min，弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞，则可直接离心收集细胞。

　　2.加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或者10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×106个/mL左右，并可适量增加牛血清浓度至20%。

　　3.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(写上细胞种类、时间及冻存条件等)。

　　4.冻存管在4℃下存放30 min，转放-20℃ 1.5～2 h，再转人-70℃ 4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃)，注意进行登记。

　　(二)细胞复苏

　　1.取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。

　　2.从液氮中取出冻存管立即投人40℃水中迅速解冻。

　　3.取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。

　　4.离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加人3 mL新鲜培养基，于小培养瓶中培养。

　　5.每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后可进行传代培养。