维生素D的测定方法

　　高效液相色谱法

　　1. 原理

　　样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。

　　2. 适用范围

　　本方法来源于GB/T 5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定;也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。

　　3. 主要仪器

　　1) 高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。

　　2) 旋转蒸发器。

　　3) 平底烧瓶：250mL。

　　4) 分液漏斗：500mL。

　　4. 试剂

　　所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。

　　1) 异丙醇：色谱纯。

　　2) 2%焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。

　　3) 75%氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。

　　4) 石油醚：沸程30～60℃。

　　5) 甲醇：色谱纯。

　　6) 正己烷：色谱纯。

　　7) 环己烷:色谱醇。

　　8) 维生素D标准溶液

　　A. 维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。

　　B. 维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。

　　5. 操作步骤

　　5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。

　　5.2测定液的制备：

　　1) 于上述样品溶液中加入100mL的20%没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75%氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。

　　2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。

　　3) 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1 min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于(绝不允许蒸干)后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。

　　4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正己烷。

　　5.3测定：

　　1) 测定液的制备：

　　A) 仪器条件：

　　色谱柱：30cm×40cm，硅胶柱。

　　流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇。

　　流速：1mL/min。

　　波长：265nm。

　　柱温：20℃。

　　灵敏度：0.005AU/MV。

　　注射体积：200mL。

　　B) 注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。

　　2) 测定步骤：

　　A) 仪器条件：

　　色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。

　　流动相：甲醇。

　　流速：1mL/min。

　　波长：265nm。

　　柱温：20℃。

　　灵敏度：0.005AU/MV。

　　注射体积：50mL。

　　B) 注射50mL维生素D标准溶液，注射50mL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。

　　6. 计算

　　ρs×10∕7×40×100

　　X =

　　m

　　As

　　ρs= ---×ρsd

　　Asd

　　式中： X--样品维生素D的量，mg/100g;

　　m--称样量，含量，IU∕100g;

　　ρs --进样液中维生素D有浓度，mg/mL;

　　A s --进样液中维生素D有峰高(或峰面积);

　　A s d --标样液中维生素D有峰高(或峰面积);

　　ρsd --标样中维生素D的浓度;

　　计算结果精确至小数点后一位。

　　7. 注意事项

　　1) 允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10%;最小检出量为0.1国标单位。

　　2) 试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。

　　3) 如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。