蛋白质含量测定法

　　本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

　　蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

　　值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。

　　考马斯亮蓝法(Bradford法)，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

　　一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法

　　样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

　　H2O

　　O=CC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　O=CCuC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　H2O

　　反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。

　　为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

　　计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

　　氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。

　　五种蛋白质测定方法比较如下：

　　方法灵敏度时间原理干扰物质说明

　　凯氏定氮法

　　(Kjedahl法)灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2%费时

　　8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三录乙酸沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长

　　双缩脲法(Biuret法)灵敏度低

　　1～20mg中速

　　20~30分钟多肽键+碱性Cu2+?紫色络合物硫酸铵;

　　Tris缓冲液;

　　某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似

　　紫外吸收法较为灵敏

　　50～100mg快速

　　5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;

　　各种核苷酸用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正

　　Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高

　　～5mg慢速

　　40～60

　　分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵;

　　Tris缓冲液;

　　甘氨酸;

　　各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;

　　颜色深浅随不同蛋白质变化

　　考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高

　　1～5mg快速

　　5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液;

　　TritonX-100;

　　SDS最好的方法;

　　干扰物质少;

　　颜色稳定;

　　颜色深浅随不同蛋白质变化