细胞爬片的制作方法

　　爬片的准备

　　1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片;

　　2. 应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于 6 孔板、12 孔板或 24 孔板;裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。 如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切 开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

　　3. 将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗 20 遍，再置于无 水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲洗 3 遍(个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好)，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

　　4. 高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。

　　5. 关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

　　【细胞爬片】

　　1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

　　2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使 玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

　　3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可 4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

　　5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出 就可以了。如果要做诸如 24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。

　　【细胞爬片的固定】 细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会 脱落。另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶 带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存 2-3 个月的片子做免疫组化是没有问题的。

　　以下为常用的固定液

　　1. 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心，丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬 片取出后，PBS洗 2 遍，便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮 和爬片的器皿盖严，防止其挥发)固定 10 分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

　　2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇 (CD)、主要组织相容性抗原等 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存。

　　3. 95%乙醇，可用于免疫组化。

　　优点：穿透性强、抗原性保存较好。 缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻， 固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存

　　4. 甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 。