微生物的分离与纯化实验

　　实验原理：

　　培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系;选择合适的理化性质;配后要及时灭菌。

　　实验原理：

　　培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系;选择合适的理化性质;配后要及时灭菌。

　　牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。

　　高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

　　从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等。

　　实验内容：

　　1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

　　(1)计算 根据配方计算出实验中各种药品所需要的量，然后再分别称量。

　　(2)称量 准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。

　　(3)溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。

　　(4)调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10%NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

　　(5)分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右;固体培养基装试管高度的1/5左右;装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

　　(6)包扎 试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。

　　(7)灭菌 培养基用0.1Mpa(15lb/in2)高压蒸汽灭菌15~20min。

　　2.培养基的高压蒸汽灭菌

　　灭菌原理：水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力增加，水的沸点和温度也随之增加。因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。一般在0.1Mpa(15lb/in2)的压力时，温度可达121℃只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。

　　灭菌方法：

　　(1)加水于灭菌器内到规定的水平面。

　　(2)需灭菌的物品(分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基)，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好(防止锅内水汽把棉塞淋湿)，放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。

　　(3)将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。

　　(4)打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5~ l0min，关闭放气阀。

　　(5)关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。

　　(6)灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。

　　(7)打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

　　(8)灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。

　　3.微生物的分离与纯化

　　借助于划线将混杂的细菌材料逐步稀释，最后在琼脂平板上分散开来，使之出现单一菌落而达到分离纯化的目的。

　　4. 注意事项

　　1.要严格按配方配制。

　　2.调pH不要过头。

　　3.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。

　　4. 划线法分离纯化微生物注意各区勿相互交叉。