如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

　　一、保留值与分离度重现性不好原因分析

问题	原因	表现
不同色谱柱间差异使用期间柱变化	填料、键合相不同 柱床破坏 键合相丢失 硅胶基质溶解 强保留组分堆积堵塞	保留因子(k), 分离因子(a） 柱效(N） 保留因子(k), 分离因子(a） 柱效(N) 保留因子(k), 柱效(N)
柱外效应	系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。	柱效(N)
分离效果变差	流动相组分改变 流速改变 温度改变	保留因子(k)，柱效变化很小 保留因子(k), 分离因子(a) 保留因子(k), 柱效变化很小
柱平衡慢	重新平衡时间不够	保留因子(k), 柱效变化很小
柱超载	样品量太大	保留因子(k), 柱效(N)

　　二、造成色谱峰( 不对称)拖尾的原因

　　1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷;

　　2.柱头有污染;

　　3.样品超载;

　　4.样品溶剂不合适;

　　5.柱外效应;

　　6.化学或二次保留(硅羟基)效应;

　　7. 缓冲容量不足或不合适;

　　8. 重金属污染。

　　三、如何解决峰形拖尾的问题

　　A. 与化学有关的拖尾问题

　　1.流动相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)， 未知化合物加醋酸三乙胺;

　　2.如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);

　　3.降低进样量至<1μg。

　　B. 与色谱柱有关的拖尾问题

　　1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗;正向柱可用甲醇冲洗;

　　2.使用保护柱。

　　C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽

　　1.进样体积过大，(通常≤25μL);

　　2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0.007");

　　3.检测器流通池的体积过大。

　　四、如何贮存色谱柱

　　1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长， 有机改性剂还有助于流动相脱气。

　　2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴最好)中，避免在缓冲溶液中保存。

　　3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂贮存。

　　4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。

　　5.将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。