倒置显微镜的使用方法

　　显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器(micromanipulator)进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。

　　显微操作的基础平台--倒置研究级显微镜各种活细胞应用实验，如显微操作、细胞培养，IVF，ICSI等.

　　显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器(micromanipulator)，这是一套能控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等，像是桃莉羊的产制就是运用细胞核移植技术达成的;而基因转殖(gene transfer)指的是将选殖之外源基因藉由导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物之生殖细胞染色体中之一门技术，基因转殖动物被定义为经由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变之动物，并可将遗传特质传递至接续的每一世代中。产制基因转殖动物可利用基因显微注射(gene microinjection)、胚干细胞(embryonic stem cells, ES cells)、精子载体(sperm vector)、反转录病毒感染(retroviral vector infection)及体细胞核移置(somatic cell nuclear transfer)等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。显微注射法(microinjection)是利用管尖极细(0.1至0.5 μm)的玻璃微量注射针，将选殖之外源基因片段直接注射入原核期胚或是培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生之重排(rearrangement)、删除(deletion)、重复(duplication)或易位(translocation)等现象而使外源基因嵌入宿主之染色体内。这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，于制造长管尖时，需用微量吸管拉长器(micropipette puller)，注射时需有固定管尖位置的微量操纵器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功的产制包括小鼠(mouse)、鱼、大鼠(rat)、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。以显微注射法转殖之外源基因较无长度上之限制，目前已证明数百 kb之DNA片段均可成功产制出基因转殖动物。而其缺点为其设备经密昂贵、操作技术需要有相当时间的练习，及每次只能注射相当有限的细胞。

　　用于显微注射用之显微镜常使用具有位相差(phasecontrast)与微分干涉差(differential interference contrast)功能之倒置显微镜，倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，一般正置显微镜之物镜在载物台之上，照明系统在下，而倒立式显微镜之物镜在下与而照明系统在载物台之上，倒立式显微镜之优点为接物镜与目镜间之工作距离较长，可直接将培养皿之置显微镜操作台上进行显微注射等工作。传统之一般普通显微镜无法直接观察未经染色之透明的活细胞，为了能让显微注射技术观察与操作透明的活细胞样品，显微镜须使用具有位相差与微分干涉差功能之倒立式显微镜。位相差显微镜是由P.Zernike于1932年发明，并因此获得1953年诺贝尔物理奖，这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的透明标本和活细胞，位相差显微镜的基本原理是利用透明细胞检体内部折射率各不相同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，得到明暗对比的效果，使的透明活细胞各种结构内部细节在亮背景视野中变得清晰可见，位相差显微镜之基本构造是利用位相差聚光镜及内部位相环所构成的环状光圈，光通过聚光镜后，产生中空光锥，并在光线穿过检体后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ(波长)，如果再经过物镜内的光延迟位环板而成增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下提高反差。虽然相差显微镜可以在透明的细胞样品提供清析的观察图像，但是一般位相差显微镜的缺点是会有「光晕」现象的产生，因而导致观察的景深受限制，无法用以观察较厚的样品，较厚的细胞团区域在一般位相差显微镜下的清稀度十分糟糕，而且边缘常产生晕轮效果，如果观察样品中有超过85%以上的区域为较厚细胞时，这个问题将非常严重，然而显微注射用之样品如受精卵细胞或细胞团均具有一定厚度，造成细胞结构和边缘无法清楚可见，因此显微注射用的显微镜必须要能克服厚样品的问题。

　　为解决活动样品和厚样品带有「光晕」的观察问题，1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。Nomarski 微分干涉差显微镜之优点是能显示结构的三维立体投影影像，与传统位相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。微分干涉差显微镜技术设计比相差显微镜要复杂得多，Nomarski DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了二个楔形单轴的晶体,如石英,以光轴互相交错的方式互相接合，称为Wollaston棱镜或 Nomarski棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将每一光线分离成为二条偏振互相垂直的两束光(x和y)，二者成一小夹角，聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束，这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少，当光程差值为0时，没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值，于是在灰色的背景上，标本结构便呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，观察者可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，改变光程差可以改变影像的亮度。而调节DIC滑行器则可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，产生了类似大理石上的浮雕感觉。 DIC显微镜使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常需要在这种显微镜下进行。

　　虽然Nomarski微分干涉技术可以对付一些细胞团或者组织等较厚的样品，但它非常昂贵，并且仅仅只能应用在玻璃底的培养皿中，无法直接在广为研究人员进行细胞培养操作之一般塑料材质的培养皿产生浮雕效果，此外这种技术对于显微操作技术的所使用的样品而言，景深还是稍嫌不足，因此在应用上遇到不少问题。有鉴于此，一些其它的可以用于观察厚样品的微分干涉技术也逐渐被开发出来，

　　目前最常用来生产基因转殖动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入授精卵的原核 (pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒立式显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holding pipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，oocyte membrance及male pronuleus membrane后，将 DNA 注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核之显微注射为例，显微注射所使用的受精卵之固定吸管(holding pipette)及注射针(injection needle)之制备困难，除影响操作时间外，亦是影响基因转殖效率及基因注入后之胚存活及基因转殖成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为 30、80 μm较为适当的。显微注射针自针尖起20 μm处之外径为4 μm时，可获得良好的转殖效率。固定吸管之内径如太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易，如太大，则受精卵易受伤害，影响胚之存活率。显微注射针尖如太粗，则导致插入透明带及原核之阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解，太细则致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核之显微注射时，如何制备适用之固定受精卵之吸管及显微注射针是关乎基因转殖效率极其重要的因素。

　　基因转殖动物(transgenic animal)于目前生物及医学研究方面之应用极为广泛，基因转殖小鼠一直是研究外源基因构筑型态、染色体嵌插、转殖基因表现及调节之最佳模式，也是建立基因转殖技术最好的工具，尤其是在产制基因转殖家畜之前，如能先以小鼠进行预备试验是求事半功倍不可或缺之过程。基因转殖动物应用的领域可以包括研究基因的活动对致癌病毒与癌细胞的生长的影响、基因的活动与免疫细胞间的交互作用与调控的机制、研究基因对于生长的调控机制，以及生物学与遗传学的机制，也被应用于以人类细胞作为组织及器官移植的发展方面，如基因参与体细胞、胚胎干细胞及存在各个组织的干细胞的体外诱导分化研究等等。基因转殖动物除用于一般基础研究外，对于制造具治疗效果的蛋白质、器官移植、疫苗、毒理实验、动物品种改良及水产养殖等均有很大的贡献。虽然截至目前为止，基因转殖之研发已有若干良好的成果，但尚有若干问题待克服，所以基因转殖技术之应用与发展将是无可限量。