结核分枝杆菌分子菌种鉴

　　①PCR菌种鉴定法。用各种分枝杆菌特异性引物对标本DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩增产物所产生的特异性片段进行鉴定;或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌种特异的内部引物进行巢氏扩增鉴定。该法灵敏、快速，但目前能够鉴定的菌种尚不多，主要有MT、牛分枝杆菌、MT复合群、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。

　　②PCR-直接测序鉴定法。用分枝杆菌属特异的引物对标本的16SrRNA或65ku抗原基因进行PCR扩增，然后直接测定扩增产物的核苷酸序列，比较其核苷酸的差异来鉴定菌种。但该方法无法鉴别少数分枝杆菌，而且技术要求高，需昂贵的特殊仪器，而难以推广。

　　③PCR-DNA探针鉴定法：用分枝杆菌属特异的引物对标本中分枝杆菌16S或16S一23SrDNA进行扩增，然后与各种分枝杆菌特异的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌种。该法较灵敏、快速，但目前只能鉴定部分菌种。

　　④PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定法。PCR-RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对标本中分枝杆菌6Sku蛋白编码基因、16S或16-23SrDNA进行扩增，然后用不同的限制性内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种。目前只能鉴定部分菌种，重复性还不够理想。

　　祖燕、张国龙等以DR为基础的Spoligo typing DNA指纹方法参照“SPOLIGO TYPlNG”一书。合成43种特异的DR间隔区短核苷酸序列，并将它们依次按顺序固化于Bio-dyneC膜(PallBiosupport公司)上，一般按膜大小固化数十排，以便可以同时完成多个临床标本的Spoligotyping鉴定工作。然后用新鲜配制的16%的EDAC(Sigma公司)溶液激活固化好的生物膜，将生物膜装置于Miniblotter MN45中待用。

　　PCR扩增结核分枝杆菌基因组DNA上的重复元件DR之间的序列，引物为

　　DRa：5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’

　　DRb：5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’

　　且DRa 5’末端标记有生物素。将PCR产物置于固定在MiniblotterMN45中的BiodyneC膜上，增强化学发光试剂盒使之杂交、显色，结果即为结核分枝杆菌Spoligotyping的DNA指纹图谱。

　　⑤PCR-单链构象多态性分析(PCR SSCP)初步菌种鉴定法。PCR-SSCP技术是目前最广泛应用的一种根据单链DNA构象差别快速、灵敏地检测基因变异的方法。由于16SrRNA 123～275位核苷酸是分枝杆菌属高度变异的区域，不同种分枝杆菌DNA单链的空间构象不同，电泳后片段的迁移率也就不同，从而呈现出不同的图谱，最终建立了新的PCR-SSCP分枝杆菌分子菌种鉴定方法。应用该方法能够鉴别MT复合群和NTM，NTM菌种之间的鉴别尚在研究之中。

　　⑥PCR-基因芯片鉴定法。基因芯片技术是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法。目前少数实验室利用分枝杆菌16S rRNA或rpoB基因某些位置上的分枝杆菌属或种特异的核苷酸变化，研究通过杂交测序鉴定分枝杆菌菌种。