维生素 D 测定法

　　精密称取供试品适量(相当于维生素 D 总量 600 单位以上，重量不超过 2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗坏血酸 0.2g 与 50%(g/g)氢氧化钾溶液 3ml[若供试量为 3g，则加 50%(g/g)氢氧化钾溶液 4ml]，置水浴上加热回流 30 分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水 10ml 冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水 60～100ml 分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚

　　振摇提取 3 次，第一次 60ml，以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约 100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约 5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液 A。

　　净化用色谱柱系统分离收集维生素 D 精密量取上述供试品溶液 A 500ml，注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙腈-水(50:50:2)为流动相进行分离，检测波长为 254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素 D 与前维生素 D 为叠峰，并能与维生素 A 及其他干扰含量测定的杂质分开;准确 收集含有维生素 D 及前维生素 D 混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干,精密加入正己烷溶液适量使每 1ml 中含维生素 D 为 50～140 单位，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液 B。取供试品溶液 B，按第一法进行含量测定，进样量为 100～200ml。