PCR成分操作和选用的注意事项

[2015/1/15]

1) 水：必须是超纯水。在1.5ml离心管内保存。
　　(2) Buffer (缓冲液)
　　? 不同公司，不同的DNA Polymerase，对应不同的Buffer。要清楚的区分。
　　? 切记要分装，避免反复冻融。第一次从公司买来要分装。一般是1ml。先250微升分装到四个管内。然后取一个管，分装50微升到五个管内。清楚标记。 ?
　　特别注意Buffer (缓冲液)是否有镁离子。如果没有需要额外添加。
　　(3) dNTP
　　不同公司，不同的DNA Polymerase，对应不同的dNTP，主要是融dNTP的溶液不同公司很有可能是不同的。要清楚的区分。
　　 切记要分装，避免反复冻融。第一次从公司买来要分装。一般是1ml。先250微升分装到四个管内。然后取一个管，分装50微升到五个管内。清楚标记。
　　(4) Primer (引物)
　　引物最核心，最重要的是特异性。学会如何利用基因组数据库去判断引物特异性。为了特异性，其他条件都是可以变动的。其他条件都是子满足特异性的前提下考虑的。
　　一般长度为 23-35 个核苷酸。但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应 
　　理想的 GC 含量为 40-60%
　　计算的退火温度(Tm)应在 50-65℃ 
　　两条引物间 Tm 差值应在 5℃ 以内避免引物形成引物内二级结构(如发卡结构)以及引物二聚体
　　当引入限制性位点时，需要在识别位点 5' 端额外添加 4-6 个碱基。如果直接用PCR产物要进行酶切反应，要额外添加6 个碱基
　　 每条引物的终浓度应为 0.1-0.5 μM; 引物浓度过高可能导致非特异性引物结合，并产生非特异性扩增产物 ?
　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 
      引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
　　引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3 等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
　　引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
　　(5) 模板：
　　 如论是总DNA还是质粒DNA纯度要尽量高。对反应是否成功至关重要。如果组织量容许，用试剂盒提取总DNA。如果组织量少，用实验室的手提方法。有两个关键点：第一步加的提取液体积要过量，以便充分混匀。最后一步乙醇清洗要进行两次;干燥要彻底，管内不能有液体。要用纯水溶解。
　　如果DNA溶解不充分，可以在75-85度水浴中处理10-20分钟，可以显著促进溶解。
　　要知道自己模板的浓度。
　　模板量根据反应用的DNA Polymerase的要求确定。
　　如果PCR DNA产物用于分子克隆，适当提高模板量，这样可以减低PCR反应的循环数，从而降低引入突变的几率。
　　(6)DNA Polymerase (DNA聚合酶)
　　如果是常规检测，目前是有 Takara Ex-Taq; 如果是分子克隆，用Takara Prime Star;纯粹学习目的，使用 全式金Easy Taq，或是 Takara rTaq.
　　(7)建立好反应体系后立即放入已经预热至变性温度的热循环仪中
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