原代肝细胞分离方法

　　体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.

　　1.1 采用非灌流的方法

　　早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.

　　1.1.1 机械分离法:

　　机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶 et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.

　　1.1.2 胰酶消化法:

　　胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平 et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank’s液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.

　　1.1.3 胶原酶消化法:

　　胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳 et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank’s液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.

　　1.2 采用灌流的方法

　　虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.

　　1.2.1 离体胶原酶灌流法:

　　离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank’s液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.

　　1.2.2 Seglen两步灌流法(原位胶原酶灌注法):

　　自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率.

　　1.2.3 半原位胶原酶灌流法:

　　半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红 et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank’s液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.

　　1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:

　　下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.

　　1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:

　　在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法.