胚胎干细胞培养操作规程

　　维持ES细胞处于未分化状态：

　　ES细胞培养用含有 ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到 80%-90%融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5%CO2，100%湿度条件下培养。

　　培养基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml FALCON管中，(稀释为2×，每管42ml)，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。

　　注：一瓶DMEM是500ml。

　　贮存液：DMEM(高糖)、马血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巯基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。

　　复苏细胞：细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

　　操作步骤：

　　1.从液氮中取出一管细胞;

　　2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟(或放到管内溶液恰好完全溶解);

　　3.将细胞转移到一15ml Falcon管中;

　　4.加入5ml ES培养基(用培养基冲洗冻存管);

　　5.离心3分钟;

　　6.弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次;

　　7.接种在明胶包被(见下文)的6孔或6cm组织培养皿;

　　8.孵育。

　　冻存细胞

　　冻存液：90%HS和10%二甲基亚砜

　　步骤：

　　1.1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内;

　　2.用细胞刮刀收集细胞;

　　3.将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟;

　　4.弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中(10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6-7ml。)

　　5.分装于冻存管内，每管1ml;

　　6.置-80℃过夜，第二天移入液氮。

　　明胶包被：准备500ml 0.1%明胶溶液

　　1.将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15～30分钟)。

　　2.最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。

　　包被培养板或培养皿

　　1.加入足量的明胶溶液覆盖培养平面(15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。);

　　2.置室温30分钟;

　　3.去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。