PCR技术概述

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。使用PCR扩增技术，可以将极微量的靶DNA片段特异地扩增上百万倍，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点，在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。

耐热DNA聚合酶的应用是PCR技术的核心。根据是否具有3’→5’端外切酶活性，耐热DNA聚合酶通常分为无校读活性和有校读活性两类。无校读活性的DNA聚合酶（以Taq 酶为代表）具有较高的扩增效率，但由于缺乏校读活性，容易发生碱基错配，故产物中点突变较多。Taq DNA聚合酶还具有末端转移酶活性，可在PCR产物的3’末端非特异地添加碱基，因单个A突出碱基的比例最高，故PCR产物可直接与含有3’末端突出T碱基的载体连接（即TA克隆），方便PCR产物的克隆、扩增和测序。然而，TaqDNA聚合酶在PCR反应第一步升温过程中即可催化错配引物延伸或引物二聚体形成，因而导致非特异性扩增，影响目的片段的合成量。针对这一现象设计的热启动Taq DNA聚合酶，在低温时其聚合酶活性被抑制，通过高温变性，聚合酶的活性恢复，催化特异性结合的引物扩增，因而提高了目的片段的特异性和产量。另一类有校读活性的DNA聚合酶（以Pfu为代表）可选择性地去除错误掺入的dNTP，维持DNA链的正确延伸；然而其扩增效率通常低于Taq DNA聚合酶，特别是对于长片段DNA链的延伸能力较差。基于上述两类酶的特点，可将适量的Taq DNA聚合酶与任意一种有校读活性的DNA聚合酶混合，在适当的反应缓冲液体系中，可获得保真性与扩增性能介于上述两类酶之间的混合酶，用于长片段以及复杂模板的高保真扩增。

PCR实验受诸多因素的影响。优质的商业化耐热DNA聚合酶及其配套缓冲液通常可以满足绝大多数DNA片段扩增的需要。首先应根据模板的性质（基因组、cDNA、质粒等）和目的片段的大小、GC含量、有无二级结构等，选择合适的DNA聚合酶。对于难于扩增的片段，应针对不同的模板、引物，优化反应条件，以获得最佳的扩增效率。

A. 模板用量：以50 μl反应体系为例
? 人基因组DNA：0.1~1.0 μg
? 大肠杆菌基因组DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 质粒DNA：0.1~10 ng

B. 引物设计原则：
? 引物长度要满足特异性需要，一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时最好在24~30个碱基之间；
? （G+C）%含量应尽量控制在40~60%，两条引物的（G+C）%含量应尽量接近；
? 尽量避免相同碱基连续出现三次以上，3’端应避免使用A或T；
? 避免引物内部自身配对形成二级结构；
? 正反向引物之间应避免配对碱基，尤其是3’端的三个碱基，否则易生成引物二聚体（Primer dimer）；
? 两条引物的Tm值应尽量接近，最好相差不超过5oC；
? 引物Tm值的计算方法：
20 nt以下：Tm = 2x（A + T）+ 4x（G+C）
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x（G+C%）-600/nt（nt：引物的碱基数）

C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根据体系不同调整用量；
? 使用简并引物、随机引物时，需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大，特异性将降低；
? 模板较大较多，或结构较复杂（如人基因组DNA）时，需减少引物用量以提高特异性；
? 模板较小较少（如质粒模板）时，增加引物用量可提高产量。