石蜡切片或细胞的原位杂交实验

实验材料：石蜡切片

试剂、试剂盒：HCl二甲苯乙醇SSCPBS链霉蛋白酶甘氨酸DTTRNA酶消化液乙酸铵

仪器、耗材：染色盘加湿盒载玻片烘箱水浴锅培养箱

实验步骤： 
1.准备脱蜡/再水化系统（可重复使用数次）及0.2mol/l HCl同时，将载有切片样品的载玻片（玻片盒中，于-20℃或-70℃贮存）置室温。开始预热2×SSC至70℃（步骤5中使用）。
2.在加有二甲苯的染色盘中进行切片脱蜡，更换二甲苯3次，毎次同隔2min（对载有未经包埋单细胞的玻片则无必要）。 
3.通过如下各组染色盘进行再水化。100%乙醇2次，每次2min；95%乙醇2 min；70%乙醇2min，50%乙醇2 min。 
4.样品室温下于0.2 mol/l HCl中变性20 min。
5.样品在70℃ 2×SSC中热变性15min，浸于1×PBS，2min。
6.在新配制的4%PFA固定液中进行样品后固定，置室温5min。于3×PBS中终止固定3min，继以1×PBS浸2次，每次30s。
7.在含10mmol/lDTT的1×PBS中平衡样品，置45℃水溶10min。
8.以新配制的封阻液进行封闭。置45℃水浴30min，水浴时用铝箔覆盖（碘乙酰胺对光敏感）。
9.室温下，以1×PBS浸洗2次，每次2min。
10.于新配制的TEA缓冲液中，平衡样品2min，移玻片架于新的TEA缓冲液中，并加乙酸酐至0.25%终浓度。快速混合，并在搅拌情况下，浸泡玻片5min。再加乙酸酐至0.5%终浓度，再浸泡5min。
11.样品移至2×SSC中浸泡5min。
12.分别以50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇（2次）浸泡进行样品脱水。室温下，每次2min（用步骤3乙醇溶液）。
13.空气干燥样品（或于干燥器中干燥）继续实验前应确证样品绝对干燥，样品放在加有干燥剂的玻片盒中，于-70℃干贮。
14.离心乙醇沆淀的反链及正链35S标记的核酸探针以及S-核糖核酸探针竞争物。沉淀干后，以5μl 无菌的5mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5μl（反应的半量）S-核糖核酸探针竞争剂于反链及正链核糖核酸探计中。
15.100℃加热3min，使探针变性。
16.立即加足量杂交液A，使探针终浓度为0.3μg/ml，充分混合。测定放射活性（期望放射活性计数值≥1×105cpm/μl）。将管置45℃水浴（杂交温度）。
17.小心在标本上铺加适量探针（如用加样吸头，按20μl/20 mm3 铺加，开始杂交）。
18.置样品于加湿盒中（载玻片水平放置），加湿盒内加入加湿盒溶液A，于 45℃温育杂交适当时间。杂交时间可进行30 min~4 h（须平衡湿盒内液体并小心密封湿盒，因为如果样品干了，将导致高杂交本底出现，加湿盒溶液与杂交混合液的渗透压必须相同，以防止杂交液稀释或浓缩）。
19.杂交过程最后一小时期间，准备并预热洗液A、B、C。
20.开始洗玻片，将载玻片浸入55℃ 100ml 洗液A中，立即放入玻片架并放入盛有溶液A的染色盘中。
21.在55℃溶液A中洗2次，每次15min 继续在55℃溶液B中洗2次，每次15min。然后，室温下，以溶液C洗2次，每次2min。
22.每一玻片上加500μl RNA酶消化液，覆盖样品全部，将玻片放入加湿盒中（盛有水），标明RNA酶专用。室温放置15min。
23.在50℃洗液C中，缓慢振摇洗玻片2次，每次30min。再于50℃洗液A中，缓慢摇洗玻片2次，每次30min 继续在室温下，以2×SSC洗玻片2次，毎次5min。
24.经以下各组液体中（毎次2min）进行脱水处理：50%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸铵、70%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸铵、90%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸铵、100%乙醇。
25.空气中干燥载玻片。压胶片曝光至少过，然后进行乳胶放射自显影。

注意事项： 
1.以上所有步骤均是将承有样品的载玻片置于玻片架中，并在盛有指定溶液的玻璃染色盘中进行，除非另有说明，所有溶液均为新配制，并只使用一次。
2.碘乙酰胺和N-乙基马来酰亚胺为剧毒物，应小心操作。