实时荧光定量PCR的使用步骤

实时荧光定量PCR的使用步骤：
1.样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离。每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀。将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗。移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2.RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1：100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定：A260下读值为1表示40mg RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40mg/ml。
具体计算如下：
RNA溶于40ml DEPC水中，取5ul，1：100稀释至495ml的TE中，测得A260 = 0.21
RNA浓度= 0.21×100×40mg/ml = 840mg/ml或0.84mg/ml
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ml，剩余RNA总量为：
35 ml×0.84 mg/ml=29.4mg
②纯度检测：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶：1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10×MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度　　成分
0.4M　　MOPS，pH 7.0
0.1M　　乙酸钠
0.01M　 EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25ml溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品：取3mgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10mg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳：上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3.样品cDNA合成
①反应体系
序号　　　反应物　　　剂量
1　　　逆转录buffer　　2μl
2　　　上游引物　　　0.2μl
3　　　下游引物　　　0.2μl
4　　　dNTP　　　　　0.1μl
5　　　逆转录酶MMLV　0.5μl
6　　　DEPC水　　　　5μl
7　　　RNA模版　　　2μl
8　　　总体积　　　　10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。