PCR扩增产物的电泳分析

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种：

一、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.

（一）凝胶浓度：凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定。
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度（%）　　线型DNA分子的分离范围（Kb）
　　0.3　　　　　　　　　　5～60
　　0.6　　　　　　　　　　1～20
　　0.7　　　　　　　　　　0.8～10
　　0.9　　　　　　　　　　0.5～7
　　1.2　　　　　　　　　　0.9～6
　　1.5　　　　　　　　　　0.2～3
　　12.0　　　　　　　　　0.1～2

（二）电泳缓冲液：核酸电泳的缓冲液有三种，即Tris-硼酸（TBE）、Tris-乙酸（TAE）和Tris-磷酸（TPE）。TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜。推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离 子抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.
10X TBE缓冲液的配制
Tris base，108克
EDTA，9.3克
硼酸，55克
H2O至1000ul
（其pH应为8.0～8.2）临用时用水稀至0.5X TBE（20倍稀释）.

（三）核酸电泳的指示剂与染色剂
1.指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色。溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便。
染色剂：核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
银染色：银染色液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。

（四）电泳
1.电泳装置：电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.
2.电泳方法：（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。
（2）根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳。
3.配制0.5X TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化。冷却至60℃（需要时可加入溴乙锭），倒入电泳槽中，待凝固。
4.向电泳槽中倒入0.5X TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。
5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。
6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。电压为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）。
7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min即可。
（3）溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N'一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表。
丙烯酰胺（%）　　有效分离范围（bp）　　溴酚兰　　二甲苯青*
　　3.5　　　　　　　100～2000　　　　　　100　　　　460
　　5.0　　　　　　　80～500　　　　　　　65　　　　　260
　　8.0　　　　　　　60～400　　　　　　　45　　　　　160
　　12.0　　　　　　　40～200　　　　　　　30　　　　　70
　　15.0　　　　　　　25～150　　　　　　　15　　　　　60
　　20.0　　　　　　　10～100　　　　　　　12　　　　　45
表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目（bp）.

（一）材料
1.电泳仪器：电泳仪及其附件。
2.30%丙烯酰胺。
3.10%过硫酸铵。
4.1X TBE电泳缓冲液。
5.TEMED（四甲基乙烯基二胺）。

（二）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳：
根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶。
1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。
3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。
5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。
6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1X TBE缓冲液。
7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则。
8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡。
9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳。
10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。
11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果。
12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染。