PCR技术的应用与微生物系统进化研究的发展

　　分类和进化研究是生物学中最古老的领域之一。过去的研究主要依靠生物体的形态，并辅以生理特征，来探讨生物间亲缘关系的远近，有人称之为经典的方法，它是一百多年来完成微生物分类的主要方法。经典的方法是随机的和不系统的，只适用于一些形态复杂的真核生物和较大的原核生物。现在，由于生物技术的不断完善，人类对自然界的认识水平不断地提高，就对以前的一些研究方法以及研究结果提出了质疑。如长久以来，生物界被划分为原核、真核两大界，认为真核生物由原始的原核生物进化而来。但随着对原核生物各类群的研究的深入，却发现许多生活在极端环境(高盐、高温、极端pH值)的古细菌(Archaebacteria)在生理生化诸多方面与一般的真细菌存在巨大差异，其分子机制亦相当独特。那么，这类古细菌是否应当从原核生物中独立出来而自成一个体系呢？近年来，由于分子生物学的迅速发展和广泛应用，特别是蛋白质和核酸序列研究的突破性进展，使微生物系统分类的基础发生了重大的变化，分类系统已经或正在随着分子标准的不断渗入而完善。所谓分子标准主要是指建立在DNA分析技术基础上的分类方法。与表型特征相比较，核酸序列在生物体的进化过程中较少受到环境的影响，因而更能反映出生物体在演变进化过程中的本质，其研究结论也更可靠。这样，人们就将系统进化研究从宏观逐渐转向微观，并把宏观和微观的特征结合起来，以便更准确地反映生物体间真正的进化关系。

　　早期的分子标准主要建立在诸如DNA碱基比例测定或核酸分子杂交等基础上。我们知道，每一种生物体均有其特有的、稳定的核酸成分和结构；不同生物间核酸成分和结构的差异程度代表着它们之间亲缘关系的远近。由此，从核酸分子水平来研究生物的进化关系就成为分类学的一个新途径，微生物分类学也不例外。最早在1956年由Lee等提出了DNA碱基比例的测定方法。DNA碱基比例主要是指“G+Cmol％"比例，即鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在整个DNA中的摩尔百分比。不同种的微生物，其4种碱基的含量及排列顺序不同，因此G+Cmol％比例一般会随种的不同而有变化。一般来说，G+Cmol％差异愈大，分类地位愈疏远。而G+Cmol％比例相似，可能属于同种，也可能不是同种，因为碱基成分相似的DNA可能有很多种碱基顺序。例如，螺菌属(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，辐度过宽。后来根据其碱基成分和其他特征的不同已被划分成3属：螺菌属(Spirillum，38％)、海洋螺菌属(Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌属(Aquaspirillum，50％～56％)。

　　如前所述，测定DNA的G+Cmol％比例只能确定含量不同的细菌为不同的种，而不能确定含量相近的细菌必然属于同一个种。若要进一步确定，还必须借助其他方法，例如核酸分子杂交方法。研究DNA-DNA或DNA-RNA杂交最方便的方法，就是采用来自一个菌株的放射性核酸与来自另一个菌珠的非放射性核酸，经热变性之后，把两种核酸样品混合，使其复性，测定放射性结合键的百分率。百分率越高，说明两者碱基顺序的同源性越高，亦即亲缘关系越近。核酸分子杂交技术对解决种水平上的分类学问题和确定新种是十分有效的。

　　从20世纪70年代初起，16S rRNA序列分析成为细菌分类的一个重要指标。16SrRNA分子具高度的保守性，在30多亿年的进化中仍保持着原初的状态，因此可用作探索自古至今生物的主要进化历程，是一种理想的研究材料。1977年，Woese等人测定了200多种原核生物的16SrRNA和真核生物的18SrRNA的寡核苷酸顺序谱，经比较研究，不但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还以此为根据提出了生命体系的三界学说，引起了生物学家的普遍关注，并由此而引发了研究古细菌的热潮。16SrRNA寡核苷酸顺序分析所依据的基本原理是这样的，用可专一性地水解G(鸟嘌呤)上3′端磷酸酯键的核糖核酸酶水解提纯的rRNA，产生一系列以G为结尾的长度不一的寡核苷酸片段，一一测定其核苷酸序列，最后把它们编成一部“词典"。两个菌株rRNA的相似性就可通过查阅“词典"来作比较。但这种方法在当时是一项工作量大，实验条件复杂和操作要求十分严格的分析技术，因此其应用仍然受一定的限制。

　　80年代中期，聚合酶链反应(PCR)的出现和完善，以及利用PCR扩增产物进行碱基序列分析方法的出现，使迅速得到特定DNA片段的遗传信息成为现实，这样就使得人们可以用完整而不是部分的DNA序列来判断生物之间的系统发育关系。1996年8月，《SCIENCE》发表了美国TICR(The Institute for Genomic Research)研究所的最新学术成果---产甲烷球菌的全基因组序列。这是自Woese提出三界学说以来测定的第一个古核生物(Archaea)的全基因组序列，从而为古核生物的研究提供了充分的序列材料。TIGR给出了产甲烷球菌的1738个基因的定位，经同源性搜索和GENEMARK的基因定位方法研究，结果表明，约有58％的基因在现有生物的基因数据库中找不到同源序列。这足以说明产甲烷球菌上有着大量的新基因序列，从而为三界学说的建立和发展找到了坚实的证据。

　　在国内，利用PCR技术研究系统进化问题尚处起步阶段。周培瑾、徐毅等人自1994年起首先开展了这方面的工作。他们用PCR技术扩增了嗜盐菌的16SrRNA；并在此基础上将一株从新疆盐湖分离到的嗜盐菌B2菌株进行了16SrRNA核苷酸序列分析；最后通过比较它与嗜盐菌各属中其他种的16SrRNA序列的相互关系，鉴定B2菌株为嗜盐小盒菌属的一个新种。他们的工作在国内，特别是嗜盐菌的系统发育研究方面尚属首次。

　　利用PCR方法研究系统进化一般要进行以下程序：
　　(1)样品来源及模板制备 用以抽提模板DNA的样品只需极少量，且模板用量也极低，只需几个纳克(新鲜样品)，抽提过程较为简单，可用经典的DNA或RNA提取法。
　　(2)对称PCR 根据选用的引物来扩增模板DNA的特异性双链片段。这个过程引物的设计至关重要。若设计不合理，扩增出非特异性片段，则会导致错误的推断。一般来说，引物应位于待分析基因组中的高度保守区域，长度以15～30hp为宜。
　　(3)不对称PCR 利用对称PCR的双链产物作为其扩增的模板DNA，控制两种引物的用量之比为1∶50或1∶100，就可根据单引物来扩增出特异性的单链DNA。
　　(4)碱基序列测定 利用单链DNA产物进行碱基序列分析。这项工作因自动测序仪的出现而变得简单易行。
　　(5)DNA序列数据分析 通过PCR得到特异性DNA片段的碱基序列只是进化研究工作中的一个中间环节，最终还必须对这些数据进行分析推断，对序列数据分析的方法很多。

　　目前，PCR技术在系统进化研究中得到广泛应用，PCR途径对模板DNA的纯度要求不高，所需样品量也极低，这就为抽提过程简单化创造了条件。可直接得到核苷酸的真实序列。这样，通过序列之间的直接比较，就更能说明问题，所得结果也更可靠。另外，在原有PCR技术基础上结合各种生化分子生物学技术，还衍生了许多改良技术，大大方便了这方面的研究工作。如PCR-SSCP是最近发展起来的一种非同位素、快速、简便、灵敏度高的检测基因突变的新技术，目前被广泛应用于筛选DNA点突变。再如PCR-RAPD可通过任意选择一个或二个引物，对基因组DNA进行扩增。扩增产物可经1.5％～2％琼脂糖电泳或在扩增的同时掺入32P，然后经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影得到DNA指纹图谱。其他还有诸如PCR定量检测技术、PCR-RELP等等。另外，继PCR扩增技术之后，又有一种新的核酸扩增技术---NASBA技术问世了。它与PCR不同的是：PCR技术要求有3个不同的温度，而NASBA只需在一种温度下就可以完成反应；NASBA的核酸扩增效率甚至比PCR的扩增效率还要高，2小时内目的基因可以扩增109倍；更主要的是NASBA能直接扩增单链RNA上的特异序列，这对RNA的研究意义非常重大。相信这项新技术的出现和广泛应用将大大加快各领域中的各项研究。

　　总之，现代分子生物学技术的迅速发展，给系统进化研究带来了越来越多的便利和可靠性，随之也推动了微生物系统发育学的建立和发展。据报道，在不远的将来，以表型为主的分类体系将发生大的变化，从而能更精确地反映微生物间的系统发育关系。