支原体检测之DNA荧光染色法

　　原理：
　　利用荧光染剂（bisbenzimide， Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine （A-T） rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。 
　　测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作荧光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 
　　待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 

　　特点：
　　简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 
　　缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。 

　　材料：
　　Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red（HBSS，GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide （Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide （Nunc 177380）或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。 
　　Indicator cells：Vero（African green monkey kidney，ATCC CCL-81 or CCRC 60013）or 3T6（mouse fibroblast，ATCC CCL-96 or CCRC 60070），细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS（medium for Vero cell） 

　　配制试剂：
　　无菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。 
　　Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。 
　　Hoechst 33258 working reagent︰取1ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。 
　　mounting solution：22.2 ml 0.1M citric acid和27.8ml 0.2 M Na2HPO4加入于50ml glycerol中混合，以1N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。 
　　固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。 

　　步骤： 
　　培养Vero细胞：Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 
　　在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃，5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 
　　接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。 
　　将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的荧光染色观察。 
　　以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基（αMEM +10%FBS）。 

　　DNA荧光染色检测：
　　取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。于每个well中，加入1ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30min。 
　　吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。 
　　以100x-400x荧光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束（330～380 nm）之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。 

　　结果判读：
　　若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其荧光可维持数星期。
　　荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。（为positive result：在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。