如何提取总RNA？

如何提取总RNA，完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源RNA酶的有效抑制；４）：有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）：对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1），提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2），直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

如何提取总RNA，方法一：总RNA的试剂盒快速提取。
一些公司推出的总RNA提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂，异硫氰酸弧（GTC）和β-巯基乙醇，加上整个操作都在冰浴下进行，这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

一：仪器：恒温水浴，冷冻高速离心机，紫外分光光度计，取液器，电泳仪，电泳槽。

二：试剂：RNA提取试剂盒，0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC），75%乙醇

三：操作步骤
（一）：细胞或组织破碎
A：微生物材料
１：发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。
２：用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。
３：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。
４：研磨后的样品转移至１２ml变性液的容器中匀浆。

B：动植物细胞培养材料（适用的样品量为细胞：108）。
1：细胞或组织培养：按常规方法进行。
2：深层悬浮培养细胞的破碎：
（1）细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3000g离心5分钟。
（2）细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3000g离心5分钟。
（3）细胞破碎：在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。
3：表面培养细胞的破碎：
（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。
（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8毫升预冷变性液，转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。
（3）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推，直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。
（4）将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中，匀浆破碎细胞。

C：植物组织破碎（适用的样品量为0.05g组织）。
（1）将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）将0.05g新鲜组织用液氮冰冻。
（3）在液氮下，研磨组织块。
（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

D：动物组织破碎（适用的样品量为1克组织）
（1）将12毫升变性液置于50毫升离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。

注1：研磨组织块用于RNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2：变性液及相应的离心管需预冷。

（二）：RNA的抽提：
在经变性液匀浆的细胞或组织600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。
离心4℃，10000g，20分钟。
沉淀RNA，冷冻干燥15分钟，RNA沉淀重新溶于300ul变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。
60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰浴中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中。
等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，~70℃保存。）

注：1变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB（42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇），65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。
2酸性酚配制：55℃时，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM，pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。