牛奶中β-内酰胺酶检测方法

“无抗奶”，顾名思义，即不含抗生素的牛奶。早在2002年，这一概念便被提出，“无抗生素”的字样也登上了乳品包装。

为何牛奶含抗生素？
牛奶中的抗生素来自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治疗乳腺发炎。乳腺炎是奶牛常见病，抗生素的使用是业内“公开的秘密”。牛奶中的抗生素可能导致饮用者过敏，或因长期接触抗生素而耐药。

如何做到“无抗”？
药品合理间隔期后才挤奶，可以生产无抗奶，可以通过检验抗生素的方式验证。

1、间接法
方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。

实验步骤：称取20g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10min。取下层清液10g于50mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15mL。振荡提取30min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1min后调节pH为8.5。以1mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2mL水淋洗。最后用3mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1mL，待上机测定。

2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。

实验步骤：称取20g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10min。取下层清液10g于50mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30min后离心，取清液经0.45μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。

标准溶液配制：称取0.01g（精确至0.001g）青霉素钾于100ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100μg/mL。根据实际情况稀释后使用。