PCR实验原理及反应要素介绍

聚合酶链式反应

一、发展简史

     聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是"微量证据"的威力之所在。

    1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。

二、实验原理

    类似于DNA的体内复制。

首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。

PCR过程是由变性，退火，延伸3个步骤组成的不断重复的过程。标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DN

2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

三、PCR反应要素：

1. DNA模版：可以是双链、单链、提取染色体的DNA、克隆的质粒DNA，
2. 引物：一对寡聚DNA，分别与模板两侧的3’端序列互补，可使DNA序列得到扩增
3. DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，
4. 缓冲液：提供DNA合成反应所需的PH,离子强度等环境
5. 4种单核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料

• 实验材料

     PCR扩增仪、PCR反应管、PCR离心管、移液器、凝胶电泳设备、冰盒、离心机

     模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反应缓冲液、Mg2+、ddH2O。

• PCR反应体系

1.   以DNA为模板的反应体系：

  模板：DNA102~105拷贝

  引物

  底物：4种dNTP

  TaqDNA聚合酶

  缓冲液

  体积：

1.   以mRNA为模板的反应（逆转录PCR）

  模板：RNA

  引物：oligo(dT)12~18

  底物：4种dNTP

  逆转录酶

  缓冲液

  其他试剂：RNA酶抑制剂，MgCl2.DTT.