教你秒懂如何使用慢病毒

病毒包装是生物医学研究中的一大利器。通过病毒我们可以高效地让我们要研究的基因在目标细胞中过表达或者特异性地敲低细胞中的目标基因。科研中用到的病毒主要有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。根据各种病毒不同的特性，不同的课题需要包装不同的病毒。比如，腺相关病毒更适合进行动物在体研究。腺病毒具有包装容量大、适合在体研究等有点。

生物医学科研中使用得最多的是慢病毒，慢病毒具有外源基因容量大、目的基因整合稳定表达、可同时感染分裂和非分裂细胞、转染效率高的特点，已经广泛应用于基础科研、临床研究中。

1、预实验的重要性

文献报道或他人经验中的MOI（感染复数，毒粒与被感染细胞的数量比值），不仅取决于病毒对细胞本身的亲噬性，而且受到不同来源重组病毒滴度测定误差、使用保存过程损失、具体细胞状态、传代次数、细胞密度、具体实验操作等方面的影响。完全照搬MOI可能并不能达到最佳效果。

传代细胞系、原代细胞等材料，实际状态在各个实验室也会存在一定差异。预实验的目的是找出能够达到最高感染效率、同时细胞状态未受到明显影响的一个恰当病毒用量。

2、预实验安排

设置不同MOI值的感染组。可设立5、10、20、50的感染复数梯度，各两孔，一孔加入终浓度为5 ug/ml的polybrene，另一孔不加。如果只需通过荧光显微镜观察，则使用96孔板即可。如需做Real-time PCR或流式检测则至少使用24孔板。在6 h、12 h、24h左右观察总结感染细胞状态，在72 h左右检测感染效率及表达水平。如为RNAi需检测蛋白水平下调可进一步延迟24 h。

如果有文献报道的MOI值，可使用该值的0.5x、1x、2x、4x进行测试。如使用较难感染的细胞进行实验，建议设置易感染细胞组如293、Hela、A549等作为阳性对照。

为了便于实验应用，且培养体系中的实际细胞数量存在计数误差，用量预实验的结论可总结为一定培养规模（如96孔板、6孔板）下、一定细胞密度时（如60%）、原始毒液加入体积（如5 μl）。当需要放大或缩小实验体系时，可根据培养面积（对应细胞数）按比例换算得出病毒用量。

3、感染方法（以24孔板为例）

第一天，准备感染细胞。在24孔板中接种目的细胞约5x10⁴/孔，每孔培养基体积0.5 ml。目的细胞的状态对于感染及表达非常重要。第二天，冻存待用的病毒于冰上融化，如需稀释毒液可以用培养基进行稀释（基础培养基或完全培养基均可，血清、双抗不影响病毒感染）。观察前一天准备的细胞，状态良好，进行病毒感染时细胞的汇合度约为50-60%左右。

按滴度计算毒液所需的用量。如原始滴度为1x10⁸ TU /ml，每孔拟病毒用量为0.5x10⁶ TU，则需要使用原液5 ul。将所需用量的毒液加入完全培养基（500ul）、混匀，吸除孔板中原培养基，加入混合毒液的培养基。放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO₂）孵育培养。根据细胞状态更换培养基，如状态良好可在12-16h更换培养基，病毒孵育时间不短于4 h。需要使用polybrene时，在孵育培养基中先于毒液加入例如5 μg/ml终浓度的polybrene混匀。

按照正常培养基条件继续培养48-72 h后可检测感染效率。在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。如载体未携带标记基因的，可以通过Real-time PCR检测目的基因表达。慢病毒表达产物在72-96 h左右接近高峰，如细胞生长代谢缓慢需适当延长时间，生长旺盛的细胞在48 h即可观察基因表达。

4、实验参考信息

（1） 常用细胞系参考MOI值

（2）常用培养器皿使用参数